基于高通量测序平台的未知病原微生物检测系统

摘要

当前，由未确证的和新出现的病原体引发的疾病负担在日益加重，这对人类的生命健康安全造成了越来越严重的威胁。近年来，我国多地发生了多起由新突发病原微生物引起的疫情，如2003年的SARS（severe acute respiratory syndrome）冠状病毒，2006年的禽流感，2009年开始的甲型H1N1流感和2013年H7N9流感。在世界范围内，还有2011年5月出现的德国大肠杆菌O104:H4疫情，2011年7月出现的荷兰超级耐药肺炎克雷伯菌Oxa4疫情，以及2014年震惊世界的西非埃博拉病毒疫情。
　　实现对未知病原微生物的快速准确检测是重大疫情疾控和日常生物安全监督的基本要求，同样地，在临床上实现病原微生物的准确鉴定对于临床正确诊断与有效防治也是至关重要。传统的病原微生物鉴定技术主要分为两类：基于细胞培养的方法例如形态学观察、细胞生理生化特征、细菌培养分型、基因芯片、自动化微生物分析系统等，和基于特异引物/探针/抗体的方法例如抗原抗体反应、PCR反应检测以及各种特异性的病原微生物快速检测系统等。这些技术在日常病原微生物确证中发挥了重要作用，但也存在一定的不足，如前者需要依赖培养、周期长、鉴定精度低，后者需要一定的微生物序列先验知识、无法应对未知或突变病原体等。
　　随着新一代测序(Next Generation Sequencing, NGS)技术的出现和迅猛发展，其在生物学和医学研究各个领域中都开始发挥重要作用，且有进入临床一线工作的趋势。在分子诊断领域，采用新一代测序技术，对不经过培养的样本进行直接鉴定，发现其他技术无法确证病原体的，已经成为可能并有多篇文献报道。在面对突发疫情和临床未知病原体诊断上，新一代测序技术比传统方法更具有优势，它无需培养、无需微生物序列先验知识、可以提供更多病原体基因组信息等。
　　因此，建立新突发“未知”病原微生物确证及溯源技术平台，有利于迅速开展针对重大公共卫生安全事件的各项防控和医疗应对措施。基于此，我们设计研究并建立了基于高通量测序平台和高性能计算平台的未知病原体检测系统，实现了对非培养临床样本的直接高通量测序和病原体诊断。该系统弥补了临床病原微生物鉴定中传统方法难以解决的问题，具有样品无需培养、无需病原体基因组先验知识、所需起始核酸量较少、高分辨率和高精确度以及提供更多病原体基因组信息等优点。高通量测序平台包括了HiSeq2500测序仪与MiSeq测序仪为主要基础的实验室病原体测序平台，和Ion torrent PGM测序仪为主的现场测序平台，并已完成对超过1000例样本的测序。高性能计算平台拥有峰值运算速度不小于20万亿次/每秒的计算系统、容量不小于500TB的高可靠存储。我们还在平台上部署了重要病原体和宿主的核酸数据库，为测序数据比对、基因组组装、分型、耐药性分析等提供基础，并且研发了未知病原微生物快速确证等软件分析流水线。最后对该平台进行了性能检测，其计算能力突出，加速效率显著。
　　临床样本测序过程中，如何对样本进行科学合理的预处理以提高病原体检测效率目前还没有清晰的认识。我们设计研究了在非培养临床标本 RNA的处理过程中，去除rRNA和mRNA以及cDNA扩增放大对后续测序结果特别是对病原体鉴定能力的影响。将人的RNA和甲型流感病毒(H1N1)的RNA混合作为一个模型，对该模拟样本进行高通量测序，通过生物信息学分析比较不同实验预处理方法下的病原体基因组复原效率，发现对非培养样品核酸进行直接测序是从样品中鉴定未知病原体的最优策略，它不仅能够准确鉴定和分型，还将产生最大的基因组覆盖度、最小的覆盖偏性和最高效的基因组复原效率。直接测序的方法，相比于去除背景核酸、DNA扩增放大和很多其它方法，其实验操作较为简单，无需经过特殊处理，这意味着更少的实验流程、更低廉的费用、更低的技术错误率和更少的实验周期，所以我们建议对非培养临床样本进行直接测序检测未知病原体。
　　在生物信息学分析方面，虽然已有许多功能相近的软件工具和工作流程，但是目前缺乏对已有生物信息学分析软件的综合比较评价。我们研究了在应用NGS技术从非培养样本中鉴定未知病原微生物时，不同数据分析软件的表现，最终给出它们的整体评价，并根据具体应用条件作出最佳方案选择。一般在测序数据质量比较好的情况下，含拼接的分析流程比不拼接的分析流程表现好。当样品中含有新颖病原体或者新序列时，不依赖于任何病原体基因组序列的de novo拼接流程则比较是适用。当通过拼接无法获得任何病原体序列时，则需要使用与微生物数据库比对过滤的流程，通过富集微生物核酸序列鉴定未知病原体。当样品中核酸主要来自于宿主时，需要在前期对宿主核酸序列进行对比过滤。
　　最后我们设计采用高通量测序的方法，对18例头颈癌（Head and neck cancer， HNC）组织样本及癌旁组织样本同时进行转录组测序，通过生物信息学分析，发现了齿垢密螺旋体(Treponema denticola)在肿瘤和癌旁中表达存在显著差异，暗示了它有可能是与头颈癌相关潜在的微生物或标志物，需要更多实验进行验证。该案例作为一个检验未知病原微生物检测系统的研究，佐证了我们建立的基于高通量测序平台的未知病原微生物检测系统是成功有效的。
　　我们的研究和评估结果将有助于指导以后的临床病原微生物鉴定分析工作，提高未知病原体鉴定的准确性和科学性，将有助于我们未来应对突发疫情时做出迅疾反应和解决临床疑难诊断问题，将有助于更好地为人类生命健康安全服务。

目录

声明

缩略词表

第一章 前言

1.1 论文研究背景

1.2 技术路线

1.3 论文组织结构

第二章 高通量测序平台和高性能计算平台

2.1 研究背景

2.2 高通量测序平台

2.3 高性能计算平台

2.4 总结

第三章 未知病原体检测的实验预处理方法

3.1研究背景

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4结论

第四章 未知病原体检测的生物信息学分析流程

4.1研究背景

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4结论

第五章 头颈癌样本中检测可疑病原体

5.1研究背景

5.2实验方法

5.3实验结果

5.4结论

第六章 全文总结和展望

6.1 全文总结

6.2 研究展望

参考文献

已发表论著

个人简历

致谢