日本脑炎病毒和甲型流感病毒热稳定性分子机制研究

摘要

病毒热稳定性是病毒颗粒的基本生理属性，主要指病毒在不同热条件下保持感染性的能力。在微生物学建立之初，研究人员发现加热可以破坏微生物的感染性。随着病毒学的建立和发展，病毒热稳定性的意义越来越丰富、应用也越来越广泛。病毒热稳定性与生物安全、疫苗保存和病毒生物功能等都有密切关系。但目前对于病毒热稳定性的分子机制、与病毒进化和传播的关系都了解甚少。本研究采用日本脑炎病毒和甲型流感病毒为模式生物，对病毒热稳定性的以上三方面进行研究。
　　日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）属于黄病毒科黄病毒属，有包膜的正链RNA病毒。日本脑炎主要流行于东南亚，给人类健康造成重大威胁。目前尚无特效药物疗法，主要通过疫苗进行预防。减毒活疫苗株SA4-14-2是俞永新院士及其合作者在1980年代通过连续传代获得。自上市以来一直保持良好的安全性和有效性。疫苗热稳定性较差，主要以干粉形式在冷链条件下运输和保存。甲型流感病毒（Influenza A Virus）属于正黏病毒科流感病毒属，流行于世界绝大部分地区。1918年西班牙大流感导致全球超过5千万人死亡。流感病毒的流行呈现明显的季节性：一般从秋季开始，在冬季达到顶峰。病毒的季节性和病毒热稳定性有一定关联，但目前尚无足够证据支持。
　　在本研究中，我们首先鉴定对JEV热稳定性有关键作用的氨基酸位点，为提高疫苗热稳定性做铺垫，然后进一步分析病毒热稳定性与病毒进化的关系。关于流感病毒，我们首先探讨病毒热稳定性与流行时期的关联，然后基于反向遗传学系统确定流感病毒热稳定性的分子基础。本研究主要包含以下三部分：
　　一、JEV热稳定性关键位点鉴定
　　利用反向遗传学技术改造病毒是一种很有潜力的提高疫苗热稳定性的策略。为找到影响JEV疫苗的关键位点，我们首先比较疫苗株SA14-14-2与其亲本株SA14在48℃和50℃热稳定性，发现疫苗株SA14-14-2较为稳定。序列分析显示，E蛋白点突变可能是病毒热稳定性差异的关键。通过将SA14的E蛋白基因嵌入SA14-14-2骨架，我们构建并拯救嵌合病毒株E70。热稳定性分析显示，嵌合株E70与SA14相当，说明JEV E蛋白对病毒热稳定性差异有决定性作用。我们进一步分析E蛋白上7个氨基酸突变对热稳定性的影响，发现突变E Q264H显著提高了病毒热稳定性。通过回复突变E H264Q，我们进一步证实E264对JEV热稳定性的关键作用。结构分析显示，E264可能参与E蛋白单体之间以及E蛋白和M蛋白之间的相互作用。突变分析显示，M蛋白上靠近E264位点的氨基酸突变的确影响病毒热稳定性。对E264所在的αB螺旋上其他氨基酸位点进行突变显示，E260和E263突变显著降低了病毒热稳定性，E261突变也一定程度降低了病毒热稳定性。我们进一步将以上发现拓展到另一种黄病毒疫苗株YF-17D上。结果显示，YF-17D E256（JEV E264同源氨基酸位点）突变降低了病毒热稳定性。因此，我们找到的氨基酸位点是广谱的影响黄病毒热稳定性的位点。
　　二、JEV热稳定性与突变抗性的共进化
　　病毒突变抗性是病毒进化过程中的重要机制，但其来源目前尚不完全清楚。这里我们考察RNA病毒中热稳定性与突变抗性是否存在共进化关系。SA14-14-2突变抗性较SA14更高。之前的实验已证明，E Q264H是两株病毒热稳定性差异的主要决定因素。如果病毒的热稳定性与突变抗性之间存在共进化关系，则该突变对病毒的突变抗性也应有重要影响。实验结果表明，E Q264H显著提高病毒突变抗性。因此，E Q264H不仅提高病毒热稳定性，也提高了病毒突变抗性。即从SA14到SA14-14-2的传代过程中的确发生了热稳定性与突变抗性的共进化现象。增殖特性分析显示，突变E Q264H降低了病毒适应性。基于适应性曲面模型，我们提出了热稳定性曲面模型和突变抗性曲面模型。在序列空间中的突变，导致病毒颗粒中分子间相互作用发生变化，从而改变了病毒的热稳定性。这种结构上的变化同时也改变了病毒的复制能力，即改变病毒的适应性。当这种改变体现在序列空间中的群体上时，病毒的突变抗性就会发生改变。本研究关注的点突变E Q264H加强了分子间相互作用，提高了病毒热稳定性。该突变降低了病毒的适应性并且使适应性曲面更为平坦，这两个因素结合导致病毒的突变抗性提高。从而，我们观察到病毒热稳定性与突变抗性的共进化现象。
　　三、流感病毒热稳定机制研究
　　流感病毒的传播呈明显的季节性。但在大流行的初期，病毒的流行时间多不符合季节性特征。为探索这种现象是否与病毒热稳定性有关，我们选取流行初期和后期的病毒株进行热稳定性比较，发现初期病毒株热稳定性明显高于后期病毒株。这很好地解释了大流行初期病毒流行不符合季节性的原因。基于反向遗传学拯救单基因片段置换的重配病毒并比较病毒热稳定性，发现PB2、PB1、HA和M片段都对热稳定性有重要影响。进一步分析我们发现，CA07病毒热稳定性比PR8高，而差异的主要原因是PB2和PB1片段。通过多片段同时置换，我们发现，PB2/PB1置换的病毒并没有在PB2或者PB1单片段置换的基础上进一步提高病毒热稳定性。同时置换HA/NA/M也获得类似的结果。这说明，不同蛋白之间相互作用对病毒热稳定性也有一定贡献。对热处理有病毒颗粒HA功能分析显示，病毒吸附能力丧失是病毒感染性丧失的原因之一。比如，PR8血凝活性稳定性远高于CA07，用CA07 HA置换PR8HA片段使病毒热稳定性降低。另外，基因组片段完整性丧失可能也是流感病毒热失活的原因之一，但有待于进一步验证。
　　综上，我们以JEV为模式生物找到了E Q264H等多个影响黄病毒疫苗热稳定性的关键氨基酸位点，并且对位点可能参与的相互作用进行了分析和验证。这些结果为进一步通过反向遗传学改造病毒以提高疫苗热稳定性奠定了重要基础。另外，我们证明，以点突变E Q264H为基础，JEV热稳定性和突变抗性发生了共同进化现象。这将共进化理论从蛋白和RNA水平推广到RNA病毒，为解释病毒的进化和疫苗的研发提供了新的理论。以流感病毒为模式生物，我们发现了大流行初期病毒株与季节性病毒株存在明显的热稳定性差异，为大流行初期流行的非季节性提供了解释。通过反向遗传学，我们确定了影响流感病毒热稳定性的基因片段为PB2、PB1、HA和M。通过吸附分析和片段完整性分析证明，病毒HA吸附性和片段完整性破坏是病毒感染性丧失的部分原因。

目录

缩略词表

摘要

ABSTRACT

前言

JEV 热稳定性关键氨基酸位点鉴定

JEV热稳定性与突变抗性

流感病毒热稳定性机制研究

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结论

参考文献

常规溶液配制及材料准备

代表性论著

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