基于代谢组学技术对金铃子散抗炎、镇痛和镇静的作用机制研究

摘要

中药复方是中国优秀文化成果的一部分，其有效性、科学性和实用性在人类健康方面发挥着重要的作用，而代谢组学的提出是中医药面向未来的发展方向,是通过对外界的扰动和环境的刺激所引发的生物体内源性物质的变化从而来定性和定量描述的方法，获得了科学界的广泛重视，尤其在中药整体性评价及生命科学领域得到了空前的发展。
　　金铃子散出自《素问病机气宜保命集》，由延胡索、川楝子(又名金铃子)组成，其化学本质是由川楝素、延胡索甲素、延胡索乙素等不同的中药物质组分所构成的体内复杂的显效形式。这些复杂的物质体系进入机体之后与机体代谢系统相互作用并产生药理作用。金铃子散复方目前在国内的研究主要是复方配伍，药物配比，制剂方面的研究，然而对金铃子散治疗机制的探索方面并不深刻。
　　本实验为了探索金铃子散在治疗过程中对已知或未知生物通路的作用。利用核磁共振及液质联用技术并结合多元统计分析方法，寻找浓度或丰度改变显著的模型差异性代谢物，通过鉴定代谢物的结构，来构建相关疾病模型体内代谢轮廓与疾病代谢表型关系的代谢网络，从代谢物水平上揭示金铃子散对调控抗炎、镇静和镇痛的作用机制的影响以及金铃子散高中低三组剂量对肝肾毒性代谢的影响。
　　具体的研究结果如下：
　　一、基于代谢组学方法研究金铃子散的抗炎作用机制
　　为探索金铃子散在治疗炎症过程中对生物体内炎症机制的调节作用。本研究采用了核磁和液质联用技术，将各组大鼠血清样本采用1H-NMR和LC-MS联用的代谢组学分析方法，并结合酶联免疫吸附法（ELISA）来测量金铃子散方对角叉菜胶所引起的大鼠足肿胀血清内炎症因子的含量变化。最后通过分析角叉菜胶致大鼠足肿胀模型中不同组别炎症大鼠体内代谢物差异的变化，发现并筛选与炎症模型相关的生物标记物，从而推测金铃子散对角叉菜胶致炎的调节机制。通过分析相关数据结果，筛选出与炎症相关的差异性代谢物有18个:鸟苷、9-顺-视黄酸、三磷酸、肌苷5'-磷酸、二磷酸肌苷、三聚磷酸盐、无机磷酸、甘油磷酸胆碱、21-脱氧皮质醇、柠檬酸、谷氨酸、琥珀酸、赖氨酸、牛磺酸、丙酮酸、苹果酸、2-酮戊二酸、甘氨酸等。相关的代谢通路有：1.柠檬酸循环（TCA循环），2.乙醛酸和二羧酸代谢，3.甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢，4.丙酮酸代谢共4条代谢通路。从代谢网络图显示金铃子散在调节机体内炎症方面，可通过调节柠檬酸，琥珀酸，甘氨酸的含量，进而减少氧自由基攻击程度，降低细胞的损伤，从而下调机体组织产生炎性因子从而起到到抗炎的作用。
　　二、基于代谢组学方法研究金铃子散镇痛的作用机制
　　为进一步了解金铃子散对小鼠体内痛症影响的代谢物变化，探索金铃子散在治疗过程中对生物体痛症代谢通路的影响。本研究采用了液质联用技术，运用代谢组学研究方法，通过建立福尔马林法、热板法、醋酸扭体法三种不同的痛症模型，测定在不同模型下小鼠血清内物质的变化，发现并筛选与镇痛相关的生物标记物，推测与痛症相关的作用模型。福尔马林法中的代谢差异物质有34个，推测得到4条相关代谢通路1.初级胆汁酸合成2.谷胱甘肽代谢3.酮体的合成和降解4.精氨酸和脯氨酸代谢。热板法中的代谢差异物质有19个，推测得到4条相关代谢通路1.抗坏血酸代谢2.戊糖、葡萄糖醛酸转换3、牛磺酸代谢4、精氨酸和脯氨酸代谢。其中精氨酸和脯氨酸代谢为福尔马林模型和热板法模型所共有。另外戊糖和葡萄糖醛酸的转化对小鼠疼痛模型的影响最为显著，可通过调节葡萄糖醛酸的含量，使轭合反应增强，从而加速清除机体的氧化代谢产物，缓解机体疼痛。在三组不同的模型实验中金铃子散可显著降低小鼠的疼痛反应表明金铃子散对外周性和中枢性痛症均有一定的抑制作用。
　　三、基于代谢组学方法研究金铃子散镇静作用机制
　　本实验是基于1H-NMR技术方法，通过观察给予金铃子散提取物后对戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠实验的大鼠血清和尿液代谢物组的变化，通过采集尿液和血清进行1H NMR检测，经多元统计分析处理，得出与镇静相关的差异性的代谢物16个，分别为甘氨酸、葡萄糖、延胡索酸、6-磷酸葡萄糖、2-酮戊二酸、甜菜碱、磷酸肌酸、肌酸酐盐、牛磺酸、胆碱、琥珀酸盐、肌酸、乳酸盐、谷氨酰胺、琥珀酰丙酮、醋酸。相关代谢通路为丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的代谢，牛磺酸代谢，甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸代谢和三羧酸循环4条代谢途径。与空白对照组相比，金铃子散组大鼠血清中乳酸和牛磺酸含量升高，谷氨酰胺含量降低；大鼠尿液中小分子代谢物酮戊二酸，肌酸酐含量降低，甜菜碱，牛磺酸水平含量升高。金铃子散组和阿司匹林组均可延长由戊巴比妥钠所致的大鼠睡眠时间，而且金铃子散与戊巴比妥钠有较好的协同作用。推测在金铃子散镇静的实验中，金铃子散在大鼠体内可通过下调谷氨酰胺、2-酮戊二酸的含量，缓解中枢神经的兴奋性，而起到调节睡眠的作用。
　　四、基于代谢组学方法关于金铃子散毒性研究
　　通过分析高中低剂量给药两周后大鼠体内尿液和血清中代谢物的变化，以及观察研究给药后一周大鼠肝肾的恢复情况，寻找大鼠体内毒性代谢物组的变化特征，筛选与毒性相关的生物标记物。根据代谢物谱中液质数据，分析实验中标记的代谢物并进行鉴定得出44个差异代谢物，最后以 MetPA对液质实验中筛选出的代谢物组进行代谢通路富集和分析，结果得到：类固醇激素合成代谢途径，戊糖和葡萄糖醛酸转换途径，赖氨酸代谢，谷胱甘肽代谢和抗坏血酸代谢5条相关的代谢通路。由代谢网络图可以看出，与毒性相关的通路主要和生物体赖氨酸代谢、葡萄糖醛酸转化及激素代谢有关，尤其是赖氨酸和谷胱甘肽的代谢失衡，造成机体能量代谢或氧化应激调节的紊乱，产生大鼠体内的损伤。从金铃子散三组剂量的亚急性毒性实验结果观察发现，金铃子散高、中剂量造成了明显的毒性作用，说明金铃子散在生物体内可产生的毒性作用，且毒性随着给药剂量的增加而增加，造成不可逆的机体损伤。
　　综上分析，中药复方金铃子散参与的疾病调节机制涵盖了机体多个系统器官的相互作用，对加强其治疗相关疾病的作用机制研究具有重要意义，本实验通过利用代谢组学中高通量的信息分析手段寻找代谢谱中的差异物，对金铃子散的治疗策略及对疾病的干预机制进行代谢通路识别和分析，为金铃子散的实验研究提供新的实验依据。

目录

声明

缩略词表

前言

1.1立项背景

1.2 研究目标

1.3 研究的关键问题

1.4 主要工作

第二章 基于1H-NMR及LC-MS代谢组学技术研究金铃子散对炎症作用机制的影响

2.1引言

2.2 实验材料

2.3. 实验方法

2.4 实验结果

2.5结 论

第三章 基于LC-MS代谢组学技术关于金铃子散镇痛作用机制的研究

3.1引言

3.2 实验部分

3.3 实验结果

3.4 结 论

第四章基于1H NMR方法研究金铃子散镇静催眠作用机制

4.1引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4实验结果

4.5 讨论

第五章 基于液质联用代谢组学技术关于金铃子散亚急性毒性研究

5.1引言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 结论

第六章 研究总结与展望

6.1 不同生物模型代谢组学研究

6.2 论文创新点

6.3 展望

参考文献

在学期间发表论文列表

致谢