石蝉草中抵制JAK-STAT和NF-κB信号通路的裂木脂素类活性成分研究

摘要

石蝉草Peperomia blanda Jacq. Kunth(Peperomia dindygulensis Miq.)，胡椒科草胡椒属一年生肉质草本植物，作为传统的民间中草药，主要用于肺癌、乳腺癌、肝癌等多种癌症以及支气管炎、肺结核等疾病的治疗。植物化学与分子水平药理研究表明，石蝉草中的主要抗肿瘤、抗炎活性成分是裂木脂素类化合物。JAK-STAT（Janus kinase-signal transducers and activators of transcription）信号通路是近几十年来国内外广泛研究的与细胞生长、凋亡以及细胞免疫相关的重要的细胞内信号转导途径，多种肿瘤以及自身免疫性疾病常伴随JAK-STAT信号通路功能的紊乱。因而，JAK-STAT信号通路是近几十年研究开发肿瘤和自身免疫性疾病治疗新药的一个重要靶点。特别是用于治疗重度类风湿关节炎的小分子JAK抑制剂Tofaticinib的上市，更加促进了该靶点及其抑制剂的研究。NF-κB（Nuclear factor-kappa B）信号通路是与炎症反应及早期的免疫反应相关的细胞内信号转导途径，是微循环障碍、类风湿性关节炎等疾病以及慢性炎症相关肿瘤的重要药物治疗靶标。
　　文献调研发现，石蝉草中的裂木脂素类化合物尤其是具有2-甲烯基取代的裂木脂素对多种肿瘤细胞有显著的生长抑制作用（2-甲烯基取代的裂木脂素还体现了良好抑制炎症反应的活性）。对裂木脂素类化合物抗肿瘤、抗炎活性具体作用机制的深入研究，以及对裂木脂素类化合物构效关系的探索将有助于阐明石蝉草抗肿瘤、抗炎的药效物质基础，促进此类新药先导化合物的发现。
　　通过建立石蝉草乙醇提取物的HPLC分析图谱，预测目标化合物所对应的色谱峰位置以及极性范围，采用萃取、真空液相色谱（VLC，Vacuum liquid chromatography）、ODS柱层析的方法对目标部位进行富集、分离，逐步提高目标色谱峰对应化合物的相对含量，采用硅胶柱层析、ODS柱层析、凝胶柱层析、结晶、半制备高效液相色谱等方法对这些目标色谱峰进行分离、纯化得到了17个低含量的化合物，综合分析质谱（ESI-MS、EI-MS）、核磁（1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC、1H,1H COSY、1D-NOE、NOESY）、圆二色光谱（ECD）解析化合物的结构，或与文献中已知化合物的结构数据对照确定化合物1～17的平面结构与立体构型。
　　确定结构的17个化合物中，包括7个新化合物（1～5为裂木脂素，6、7为四氢呋喃木脂素）与10个已知化合物（8～14为裂木脂素，15、16、17为其他类别化合物），化合物8为新天然产物，化合物15、16、17为本属植物中首次分离，化合物10、13为石蝉草中首次分离。
　　17个化合物分别为：(3S)-2-甲烯基-3-[(4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯基)(3'',4'',5''-三甲氧基苯基)甲基]丁内酯（1），(3S)-2-甲烯基-3-[(3'-羟基-4',5'-二甲氧基苯基)(3'',4'',5''-三甲氧基苯基)甲基]丁内酯（2），2-甲基-3-[(3'-羟基-4',5'-二甲氧基苯基)(5''-羟基-3'',4''-亚甲二氧基苯基)甲基]丁内酯（3），(2S,3S)-2-甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亚甲二氧基苯基)(3'',5''-二羟基-4''-甲氧基苯基)甲基]丁内酯（4），(2R,3S)-2-羟甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亚甲二氧基苯基)(4''-羟基-3'',5''-二甲氧基苯基)甲基]丁内酯（5），(7S,7'S,8R,8'R)-7-(5-甲氧基-3,4-亚甲二氧基苯基)-7'-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8,8'-二羟甲基四氢呋喃（6），(7S,7'S,8R,8'R)-7,7'-双(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-8,8'-二乙酰氧甲基四氢呋喃（7），2-甲烯基-3-[双(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基]丁内酯（8），(3S)-2-甲烯基-3-[(4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯基)(5''-甲氧基-3'',4''-亚甲二氧基苯基)甲基]丁内酯（9），2-甲烯基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亚甲二氧基苯基)(3'',4'',5''-三甲氧基苯基)甲基]丁内酯（10），草胡椒素E（11），草胡椒素H（12），2,3-反式-2-甲基-3-[(3',4',5'-三甲氧基苯基)(5''-羟基-3'',4''-亚甲二氧基苯基)甲基]丁内酯（13），(2S,3S)-2-甲基-3-[(3',4',5'-三甲氧基苯基)(5''-羟基-3'',4''-二甲氧基苯基)甲基]丁内酯（14），(+)-(7S,7'S,8R,8'R)-4,4'-二羟基-3,3',5,5'-四甲氧基-7,9',7',9-双环氧木脂烷（15），(6R,7E,9R)-9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮（16）enferamide（17）。
　　本课题组前期从石蝉草中分离得到7个含量较高的裂木脂素类化合物，分别为：草胡椒素A、草胡椒素B、草胡椒素C、(2S,3S)-2-甲基-3-[(3',4',5'-三甲氧基苯基)(4''-羟基-3'',5''-二甲氧基苯基)甲基]丁内酯、(2S,3S)-2-甲基-3-[(3',4'-二羟基-5'-甲氧基苯基)(3'',4'',5''-三甲氧基苯基)甲基]丁内酯、(–)-2,3-顺式-2-乙酰氧甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亚甲二氧基)(4''-羟基-3'',5''-二甲氧基)甲基]丁内酯、1,2-反式-2,3-顺式-2-乙酰氧甲-3-[(5-甲氧基-3,4-亚甲二氧基苯基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基]四氢呋喃-1-醇。
　　本次分离得到的12个裂木脂素与前期分离的7个裂木脂素按照γ-丁酯环上C-2位取代基的类型可分为：6个2-甲烯基取代型裂木脂素，12个2-甲基取代型裂木脂素，1个2-羟甲基取代型裂木脂素，1个2-乙酰氧甲基型裂木脂素以及1个γ-丁酯环上羰基被氧化为羟基的裂木脂素。
　　测定这19个裂木脂素对IFN-γ/STAT1、IL-6/STAT3与TNF-α/NF-κB信号通路的抑制活性，活性测定结果表明：2-甲烯基取代型裂木脂素对JAK-STAT信号通路具有强的抑制活性（抑制IFN-γ/STAT1和IL-6/STAT3信号通路的IC50分别为1.35~10.53μM、0.59~7.12μM），其中草胡椒素E对JAK-STAT信号通路具有最强的抑制活性（抑制IFN-γ/STAT1和IL-6/STAT3信号通路的IC50分别为1.35μM和0.59μM）。(–)-2,3-顺式-2-乙酰氧甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亚甲二氧基)(4''-羟基-3'',5''-二甲氧基)甲基]丁内酯以及2-甲基-3-[(3'-羟基-4',5'-二甲氧基苯基)(5''-羟基-3'',4''-亚甲二氧基苯基)甲基]丁内酯对TNF-α/NF-κB信号通路具有强的抑制活性（IC50分别为2.25μM与3.09μM）。
　　构效关系研究表明：裂木脂素类化合物γ-丁酯环上的羰基是抑制JAK-STAT信号通路的必需基团，内酯环上C-2位被甲烯基取代能大幅度提高裂木脂素对JAK-STAT信号通路的抑制作用，2-甲烯基取代型裂木脂素芳环上亚甲二氧基的数目与JAK-STAT信号通路的抑制活性呈正相关。
　　创新性：
　　1.从石蝉草中分离得到了17个低含量的化合物，其中包括7个新的木脂素类化合物（5个裂木脂素和2个四氢呋喃木脂素），7个已知的裂木脂素以及3个其他类别的化合物。
　　2.分离的12个裂木脂素的γ-丁酯环与两个芳环上的取代基具有丰富的结构多样性，这些化合物包括6个可能具有高活性的2-甲烯基取代型裂木脂素、1个2-羟甲基取代型裂木脂素以及5个2-甲基取代型裂木脂素，进一步丰富了本课题组获得的裂木脂素类化合物的结构类型，为下一步的构效关系研究提供了坚实的化合物基础。
　　3.首次发现6个2-甲烯基取代型裂木脂素对JAK-STAT信号通路具有高抑制活性（对IFN-γ/STAT1与IL-6/STAT3的IC50值均小于10μM，其中最强活性的草胡椒素E抑制IFN-γ/STAT1与IL-6/STAT3的IC50值分别为1.35μM与0.59μM）。部分裂木脂素对TNF-α/NF-κB信号通路具有高抑制活性（(–)-2,3-顺式-2-乙酰氧甲基-3-[(5'-甲氧基-3',4'-亚甲二氧基)(4''-羟基-3'',5''-二甲氧基)甲基]丁内酯与2-甲基-3-[(3'-羟基-4',5'-二甲氧基苯基)(5''-羟基-3'',4''-亚甲二氧基苯基)甲基]丁内酯抑制TNF-α/NF-κB信号通路的IC50值分别为2.25μM与3.09μM）。
　　4.通过构效关系研究，首次发现γ-丁酯环上的羰基是裂木脂素抑制JAK-STAT信号通路的必需基团，羰基被还原为羟基后失去活性，而C-2位被甲烯基取代可以极大增强对JAK-STAT信号通路的抑制作用。
　　以上研究结果为裂木脂素类化合物进一步的结构改造、作用机制研究以及药物先导化合物发现提供了良好的研究基础。

目录

声明

缩略词

1 立题依据与国内外研究进展

2 拟解决的科学问题

2.1 待分离目标化合物的定位

2.2 低含量的化学成分的富集与分离

3 研究思路

3.1 目标化合物的定位

3.2 目标部位的富集

3.3 目标化合物的分离与纯化

3.4 过程分离情况监测

3.5目标化合物的结构鉴定

3.6裂木脂素类化合物对JAK-STAT信号通路抑制活性的评价

3.7 裂木脂素类化合物构效关系分析

4研究方法

1.1 概述

1.2.1对照品及试剂、仪器、药材

1.2.2色谱条件的选择与优化

1.3 HPLC分析结果与讨论

第二章 石蝉草裂木脂素类化学成分研究

2.1 分离得到的化合物

2.2 化合物结构解析

2.3实验部分

2.3.1实验仪器、材料与药材

2.3.2 提取与分离

2.3.3化合物结构测定数据

第三章 裂木脂素对JAK-STAT、NF-κB信号通路抑制活性筛选研究

3.1 供活性测定的19个裂木脂素的结构

3.2 裂木脂素对JAK-STAT、NF-κB信号通路的抑制活性筛选数据

3.3 活性筛选小结与讨论

3.4 实验部分

3.4.1 仪器与材料

3.4.2 方法

第四章 研究总结

参考文献

作者简介

致谢

附图