选择性氨杂吲哚类JAK抑制剂的设计、合成及体内外活性评价

摘要

类风湿性关节炎（RA)是一种全身性自身免疫性疾病，也是临床上常见的慢性疾病。这种疾病的特征在于持续关节滑膜炎和全身性炎症，小关节处是RA患者中常见的病变部位，发病初期的症状一般表现为关节肿胀、疼痛、发僵。然而，滑膜炎反复发作并且持续存在，这会导致患者关节软骨和骨的不可逆损伤，严重影响其正常活动，给其生活带来极大的不便。病情发展严重时，对患者可致畸致残，也存在引起心血管或是其他并发症的可能性。
　　关于RA的发病机制，至今尚无明确而系统的阐述。在已有的研究基础上，人们比较认同的观点是：各种各样复杂的内因和外因共同作用，致使患者体内滑膜细胞和软骨细胞行为异常，许多细胞因子过量产生。这些细胞因子通过不同的方式激活关键的信号转导通路，形成一系列炎症级联反应，最终导致患者关节滑膜结构损伤，表现出RA的典型临床症状。
　　正是由于RA发病机制的复杂性，对其治疗的方案也多种多样，但目前都未能达到将RA完全治愈的理想效果，人们只能以短期治疗来追求长期缓解。不同的治疗手段在RA的治疗方面都发挥着重要的作用，而各种有效的治疗手段中最为重要的当数药物治疗，非留体抗炎药、改善病情抗风湿药和糖皮质激素三大类药物一度成为治疗R A的经典药物，在市场上占有重要的地位。随着人们对RA研究的日渐深入，具有新的作用机制且治疗效果更好的药物成为了 RA治疗市场上的新起之秀。近年来，化学小分子蛋白质激酶抑制剂（PKi)在疾病治疗方面的应用吸引了众多医药工作者的注意力，它在RA治疗领域的应用也成为了人们的迫切期待。
　　Janus激酶(JAK)、脾酪氨酸激酶(Syk)和p38激酶等成为了治疗R A的热门蛋白质激酶靶点。其中靶向JA K的药物研发已经取得成功，辉瑞公司研发的Tofacitinib和因赛特与礼来公司联合研发的Baricitinib就是这类药物的代表。但Tofacitinib和Baricitinib对 JA K的亚型激酶抑制作用没有单一的选择性，它们的临床试验结果表明，单一亚型的JA K抑制剂或许会在保持良好的R A治疗效果的同时，避免或减小不必要毒副作用的产生，提髙其应用的临床安全性。
　　为了寻找并研发具有JA K亚型激酶抑制选择性的化合物分子，本课题选择以Baricitinib分子为先导化合物，参考已经报道的Tofacitinib分子与JA K各亚型间的作用关系，同时还借鉴在研的具有单一亚型选择性抑制作用的JA K抑制剂Filgotinib(作用IE点为JAK1)和 Decemotinib(作用IE点为JAK3)的分子结构，利用生物电子等排、优势分子片段拼接等策略进行分子结构优化和改造。在目标化合物的化学合成过程中，本课题探索并改进了合理的合成路线，针对关键步骤的反应条件和关键中间体的合成方法进行了的优化，提升了目标化合物实验室放大合成实验操作的可行性。最后使用毛细管电泳方法通过检测底物肽段磷酸化转化率，测定了目标化合物对3种 JA K亚型激酶（JAK1、JAK2、JAK3)的半抑制浓度（IC50)值（由于与 TYK2的主要相关疾病是牛皮癣和炎症性肠病而并非类风湿性关节炎，因此并未测定目标化合物对 TYK2的抑制活性)，以此来评价所设计并合成的目标化合物体外JA K抑制活性和选择性。
　　在目标化合物分子的设计过程中，本课题先对先导化合物分子进行了母核的改造，用C-3位取代的7-氮杂吲哚结构替换Baricitinib分子中的7/f-吡咯并[2，3峋嘧啶结构，以保证目标分子在JAK铰链区的有效固定，并进一步对酰胺尾部进行了优化，重点考察了不同的取代酰胺对化合物体外酶抑制活性的影响，设计得到此类化合物J-01-J-10，10个目标化合物结构均未见报道。通过体外JAK抑制活性测试，发现此类目标化合物相比于B aricitinib活性有所下降，但都表现出了激酶亚型抑制选择性，尤其是化合物J-01和 J-04分别对JA K2和 JA K1表现出了较好的抑制选择性。并且发现尾部的酰胺取代基对这类化合物抑制选择性的影响较大，小的脂肪环取代基有增加JAK选择性的作用，而芳环取代基则更有利于提高目标化合物对JAK1的抑制选择性。另外，改构所得的此类分子中，氰基结构与激酶间的作用效果不易被其他基团替代，将氰基结构变换为氨基或三氟乙胺基后，目标化合物的体外JAK抑制活性有显著降低。
　　另一方面，本课题又对化合物分子母核上的连接基团部分进行了片段拼接,借鉴Filgo tinib分子中的苯环连接片段，将其拼接至化合物分子中的7-氮杂吲哚骨架上得到目标化合物J-11-J-14,也尝试着直接将该片段拼接至Baricitinib分子中的7/f-吡咯并[2，3-4嘧啶结构上得到目标化合物J-15~J-19，设计得到了9个未见报道的新结构目标化合物。体外 JA K抑制活性试验结果显示，化合物J-11-J-14的激酶抑制活性下降的较为明显，而且并未表现出理想的抑制选择性。然而目标化合物J-15-J-19的酶抑制活性虽然也有降低，但其中目标化合物J-16和J-19都对JAK2表现出了较好的抑制选择性。
　　在目标化合物的化学合成过程中，分别选择以3-溴-7-氮杂吲哚和4-氯-7丑-吡咯并[2,3-4嘧啶为起始原料，经过氨基保护、Suzuki芳基偶联、Michael加成、亲核取代、水解、催化缩合、氨基去保护等关键步骤来合成目标化合物分子，并通过核磁氢谱进行了化合物的结构鉴定。最后还对Suzuki芳基偶联反应的最佳实验条件及关键中间体7a~7g的合成路线、方法进行了探索改进，合理地避开了化学性质不稳定的中间体，以获得理化性质较稳定的关键中间体，为目标化合物在实验室放大合成的工艺改进和优化奠定了基础。
　　本课题中设计并成功合成了共19个目标化合物，其结构未见文献报道，并对其体外Janus激酶抑制活性进行了评价，结果表明化合物J-01、J-04、J-16和J-19为选择性JA K抑制剂，为该课题的进一步深入研究奠定了基础。

目录

声明

缩略词

第一章 前言

1.1 类风湿性关节炎

1.2 JAK/STAT信号转导通路及其与RA的关系

1.3 用于RA治疗的JAK抑制剂的研究现状

第二章 目标化合物结构与合成路线的设计

2.1 目标化合物的设计

2.2 化合物合成路线设计

第三章 目标化合物的合成实验及物理数据

3.2 关键中间体的合成

3.3 目标化合物的合成及结构鉴定

第四章 目标化合物的体外酶活性评价

4.4 实验结果

第五章 讨论

5.2 生物活性部分

结论

参考文献

附录

学术论著：氮杂吲哆类Janus激酶抑制剂的合成及太歪活性评价

个人简历

致谢