外周血造血干细胞来源微泡的生物学特性

摘要

造血干细胞（hematopoietic stem cells）是一类异质性的、具有自我更新和多向血细胞分化潜能的成体干细胞。根据来源不同，其可分类为骨髓造血干细胞，脐血造血干细胞,胎肝造血干细胞和外周血造血干细胞。因外周血造血干细胞（PB-HSC）具有采集方法简便，短期内可重复采集，受者输注后造血、免疫功能重建快，且植入率高等优点，在移植和细胞免疫治疗方面发挥日益重要的作用。
　　微泡(MV)是细胞分泌的亚微米双层膜结构，包括从内涵体分泌的外泌体，以及从绝大多数细胞膜表面分泌的微粒。其含有母体细胞的蛋白质、脂质、mRNA以及microRNA等成分，通过与其它细胞融合，将其内容物释放到靶细胞，影响其功能，从而在不同细胞间信息传递过程中发挥重要作用。微泡可由多种细胞分泌，并广泛分布于血浆、唾液、乳汁、汗液等各种体液中。不仅正常细胞可分泌微泡，肿瘤细胞也可以分泌微泡：在肿瘤病人的体液中可以检测到微泡。因此在生理和病理状态下,不同细胞分泌的微泡是一个混合的群体。微泡随着细胞的来源、数量、大小和抗原成分的变化而不同。
　　外周血造血干细胞具有免疫调节，促进造血恢复等作用。因为微泡带有母体细胞的信息，所以我们推断外周干来源的微泡可能也具有同样的功能。而且研究表明，微泡没有或者具有很小的免疫原性，如果其具有一定的功能，可具有广泛的临床应用。但是，目前对外周血造血干细胞来源的微泡研究甚少。本研究旨在对外周血造血干细胞来源的微泡进行生物学特性探究，尤其对其免疫调节和促造血功能加以探索。
　　研究目的提取并鉴定正常人外周血造血干细胞来源的微泡，并研究其生物学特性：包括探究正常人外周血造血干细胞来源的微泡的免疫调节功能及对造血集落形成的影响。
　　研究内容将正常人外周血造血干细胞提取并培养，从培养上清中提取出外周血造血干细胞来源的微泡并鉴定，研究其生物学特性：探究正常人外周血造血干细胞来源的微泡对外周血单个核细胞是否具有免疫调节功能？及正常人外周血造血干细胞来源的微泡是否对造血集落形成有影响？
　　研究方法:
　　（1）利用密度梯度离心法分离正常人动员后外周血造血干细胞，收集培养第48小时上清液，超速离心法分离提取微泡;
　　（2）通过电子显微镜观察微泡形态；采用bicinchoninic acid(BCA)法标定微泡数量；采用流式细胞仪检测其表面标志物；
　　（3）将微泡与正常人外周血单个核细胞(PB-MNC）共培养12h后，通过共聚焦扫描电镜观察微泡与单个核细胞的作用方式；共培养48h后采用酶联免疫吸附试验法(ELISA）法检测上清中IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ及TNF-α的分泌量；共培养48h后采用流式细胞仪检测T细胞亚群及T细胞激活变化；共培养48h后采用流式细胞仪检测不同亚群细胞胞内细胞因子染色情况；
　　（4）采用甲基纤维素半固体培养基检测微泡及微泡与单个核细胞共培养48小时后上清液对外周血造血干细胞集落形成的影响。
　　研究结果:通过密度梯度离心法可提取出动员后外周血造血干细胞。利用超速离心法可成功提取出外周血造血干细胞来源的微泡。透射电子显微镜观察分离得到的微泡为卵圆形膜性小囊泡。流式细胞术测得微泡高表达其特异性标志CD63(85.86％),并带有其母体细胞标志如干细胞标志CD34(33.52%)，T细胞标志CD3(43.98%)、CD45RA(23.54%)、CD45RO(68.3%)，NK细胞标志CD56(32.32%)等。共聚焦扫描电镜显示微泡可以与外周血单个核细胞相融合并促进其分泌IL-6,IL-8，IL-10与TNF-α细胞因子。流式细胞仪检测结果显示T细胞亚群及T细胞激活无明显改变。胞内因子染色结果表明CD4+,CD8+,CD11c+细胞内因子无明显改变。集落培养实验表明微泡及微泡与单个核细胞共培养48小时后上清液很可能具有促进造血集落形成的作用。
　　研究结论:外周血造血干细胞来源的微泡具有免疫调节及可能促进造血集落形成的作用。

目录

声明

缩略词表

前言

第一章动员后外周血造血干细胞来源微泡的提取与鉴定

第一节 动员后外周血造血干细胞来源微泡的提取

第二节 电镜鉴定微泡形态

第三节 微泡的定量

第四节 微泡表面抗原的鉴定

第二章动员后外周血造血干细胞来源微泡对单个核细胞的免疫调节作用

第一节 共聚焦扫描电镜观察微泡进入正常人外周血单个核细胞

第二节 微泡调节正常人外周血单个核细胞细胞因子的分泌

第三节 微泡对T淋巴细胞的影响

第四节 微泡对各细胞亚群因子分泌的影响

第三章微泡对造血干细胞集落形成的影响

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

讨论

结论

参考文献

已发表论著:外周血造血干细胞来源微泡的生物学特性

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