骨髓间充质干细胞微泡生物学特性及促进造血干细胞体外扩增作用的研究

摘要

研究目的：近年来，异基因造血干细胞移植已经成为了治疗恶性血液系统疾病和各类免疫系统相关疾病的最佳方法之一。随着细胞治疗和造血干细胞移植的不断发展，动员后外周血造血干细胞便于采集，侵入性小并且可短期多次获取，逐渐取代了骨髓干细胞，成为造血干细胞移植和细胞治疗的主要细胞来源。尽管如此，细胞数量不足，病人无法获得足够多的供者细胞，仍然是钳制移植发展的主要瓶颈。本实验旨在寻求安全有效的方法，在体外扩增外周血造血干细胞，以期获得效用良好的细胞产品，为临床应用提供发展的新思路。研究内容1.从骨髓间充质干细胞培养上清中提取微泡，并从形态学特征，蛋白浓度测定和表面标志三个方面鉴定微泡。2.在实验中，我们首先选择了间充质干细胞微泡作为扩增方法。利用间充质干细胞微泡与动员后外周血单个核细胞共培养，观察微泡对GPBMC的作用。3.在此基础上，我们还利用了芳香烃受体抑制剂SR-1作为添加物。SR-1是一种嘌呤衍生物，它能够在扩增造血干细胞的基础上维持其自我更新的能力。本实验中，我们将微泡联合SR-1与外周血单个核细胞共培养，观察其扩增作用。4.对扩增后的细胞在小鼠体内进行了初步的有效性和安全性验证。
　　研究方法：1.通过培养间充质干细胞获取培养上清，利用超速离心机，多步差速离心法分离并提纯上清中间充质干细胞的分泌物。通过将提取物负染，在透射电镜下观察其形态学特征；用Micro-BCA试剂盒对微泡进行蛋白浓度的测定，利用标准曲线计算出蛋白浓度；最后，利用流式细胞术分析提取物所表达的表面标志。2.探究了微泡对外周血造血干细胞的扩增作用。实验分为对照组和微泡组，微泡组内加入10mg/L微泡，对照组内加入相同体积P B S缓冲液。采用液体培养法，将从供者动员后外周血中提取出的单个核细胞与微泡共培养，通过细胞计数检测细胞在培养后的数量变化；通过流式细胞术检测培养后的单个核细胞中CD34+细胞含量的动态变化情况；用甲基纤维素半固体培养基对培养后的造血干细胞行集落培养，观察其在体外的功能；分析染色体核型变化，以观察培养前后的细胞是否有染色体畸变等情况。3.在微泡组实验的基础上，在相同培养体系内加入了 SR-1小分子制剂。实验分为四组，即对照组，微泡组，SR-1组，混合组。其中，微泡组中加入10mg/L的微泡，SR-1浓度为0.75μm，混合组为10mg/L微泡+0.75μm SR-1，对照组则加入等体积PBS缓冲液。我们通过细胞计数，细胞表面标志鉴定，集落培养和染色体核型分析等方法，检测微泡与SR-1联合培养的细胞的扩增情况。4.从以上实验组中筛选出在细胞数目得到扩增的同时保持CD34+细胞数量与能力不减弱的实验组，对小鼠进行初步的体内实验探究，以在体内验证获得的扩增细胞的有效性及安全性。实验分为两组，实验组与对照组。实验组输入培养后的细胞，对照组输入新鲜采集的外周血干细胞。给予NPG小鼠2Gy TBI全身照射，采用流式分选的方法，将培养后细胞与新鲜采集的细胞中CD34+细胞分选出来，向两组小鼠分别输入1×105的CD34+细胞。观察小鼠血象恢复，利用流式细胞术分析1w,4w小鼠体内人鼠细胞嵌合比例、血象恢复情况与生存率情况。
　　结果：1.证实通过多步差速离心法能够成功提取微泡，电镜下可见微泡是直径在20-100nm的类圆形囊泡，这与文献中已经报道过的的胚胎干细胞、肿瘤细胞来源的微泡特征一致；蛋白定量的结果显示，计算所得平均每1×106个间充质干细胞培养上清中获取微泡10μg;间充质干细胞微泡表面标志结果显示，CD63与 CD44阳性表达，CD63表达率96.0％，CD44表达阳性，而HLA-DR，CD34， CD29等表达均为阴性。从电镜下形态学特征，蛋白定量和表面标志的检测，认为通过此方法获取的间充质干细胞分泌物是微泡。2.实验结果显示，微泡对外周血单个核细胞具有促进增殖的作用，微泡组有明确促进造血干细胞扩增的作用，细胞数量随共培养的时间延长而增加。起始种植细胞为1×106个，2 d时微泡组细胞数（3.34±0.44×106)是对照组（2.24±0.26)的1.49±0.15倍（P＜0.05);4 d时微泡组细胞数（10.19±0.65×106)是实验组细胞数（4.67±0.70×106)的2.20±0.24倍（P＜0.05)，6 d时微泡组细胞(27.15±3.28×106)是实验组细胞数(11.40±0.58×106)的2.37±0.21倍（P＜0.05)。结合细胞总数与 CD34+细胞的比例，我们发现2 d时，对照组与微泡组中CD34+比例相差不大；4 d时，对照组中 CD34+比例高于微泡组。将 CD34+比例与细胞总数综合分析，2 d时微泡组CD34+细胞数（3.93±0.60×104)是对照组（2.30±0.64×104)的1.76±0.30倍；4d时微泡组 CD34+细胞数（7.82±0.41×104)是对照组（4.03±0.35×104)的1.95±0.20倍。此外，微泡组中的CD34+细胞具有在体外形成集落的能力，经过长时间培养后染色体正常，无畸变。3.实验结果表明，单独使用S R-1与造血干细胞共培养，2 d时细胞数量（2.07±0.21×106)和4 d时细胞数量(5.34±0.58×106)与对照组均无明显差异（P＞0.05); SR-1联合MV的混合组与造血干细胞共培养，2 d时细胞数量（2.38±0.34×106)与对照组无明显差异（P＞0.05)，4d时细胞数量(6.56±0.86×106)是对照组的1.42±0.22倍（P＜0.05)； SR-1组整体细胞数量无明显差异，2 d时 CD34+细胞的绝对数（3.27±1.47×104)与4 d时CD34+细胞绝对数（4.61±0.63×104)均略高于对照组。与微泡组相比，M+S组细胞扩增倍数低，但2d时 CD34+细胞数量（5.42±1.64×104)与4 d时（8.83±2.50×104)比同时间微泡组中CD34+细胞数量均高。
　　4.实验结果显示，小鼠血中人鼠细胞比例嵌合在4 w左右均达到10%左右，对照组与实验组间无明显差异。
　　结论：利用多步差速离心法可成功提取出间充质干细胞微泡，间充质干细胞微泡对外周血造血干细胞有促进扩增的作用；间充质干细胞微泡与SR-1联合与造血干细胞微泡培养能够使细胞扩增并能较好地维持其干性。

目录

声明

缩略词表

前言

第一章间充质干细胞微泡的提取和鉴定

第一节间充质干细胞培养上清微泡的提取和电镜下形态学鉴定

第二节间充质干细胞微泡的蛋白定量

第三节间充质干细胞微泡表面抗原的流式鉴定

第二章间充质干细胞微泡对GPBSC的增殖作用

第一节共培养后GPBSC的数量増殖

第二节共培养后的GPBSC的表面标志动态监测

第三节共培养后的GPBSC集落培养

第四节共培养后的GPBSC染色体形态检测

第五节间充质干细胞微泡联合小分子SR-1对外周血造血干细胞的增殖作用

第三章小鼠体内实验初步探究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

讨论

结论

参考文献

论著：骨髄间充质干细胞微泡生物学特性及促进造血干细胞体外扩增作用的研究

个人简历

致谢