肉毒毒素重组基因工程疫苗研究

摘要

肉毒毒素又被称为肉毒神经毒素，是由厌氧的革兰氏阳性菌肉毒梭菌产生的外毒素，是已知毒性最强的蛋白，根据其抗原性不同可以分为7种类型（BoNT/A-BoNT/G），A、B、E和F型可以导致人类中毒，其中A型肉毒毒素中毒致死率最高。各型肉毒毒素分子结构比较相似，分子量大小约150 kDa，由二硫键连接一个100 kDa的重链（HC）和一个50 kDa的轻链（LC）组成。肉毒毒素重链羧基端（HC）负责与细胞受体的结合，重链氨基端（HN）介导L链的跨膜转运；轻链具有锌离子内肽酶活性，能够将可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）切割而抑制神经递质的传递，最终会导致骨骼肌麻痹，呼吸衰竭而死亡。
　　肉毒毒素生产工艺简单，稳定性良好，具有极强的致死性，是一种潜在的生物武器，极容易被制备成生物战剂应用。此外，近些年来由于肉毒毒素导致的中毒事件也时有发生，因此，对于预防和治疗肉毒毒素中毒的研究具有十分重要的意义。接种疫苗是一种有效预防肉毒毒素中毒的策略。鉴于早期研制的类毒素疫苗存在较多的缺陷，所以一直未能得到十分广泛的应用，因此研究新型肉毒毒素疫苗成为一种迫切的需要。破伤风毒素（TeNT）和肉毒毒素在结构上有较多的相似之处，所以借助于破伤风毒素 Hc片段亚单位疫苗研究成功的策略来研制肉毒毒素亚单位疫苗。肉毒毒素受体结合区 Hc能介导毒素特异性结合到神经肌肉接点处的神经末梢，此外，Hc片段不存在锌肽链内切酶活性，没有毒性，免疫动物后能刺激产生保护性免疫反应。基于这一重要发现，研究人员开始以肉毒毒素受体结合区 Hc为靶标，开展新型肉毒毒素重组亚单位疫苗和核酸疫苗的研究。
　　DNA疫苗是将编码抗原的基因克隆到真核表达载体中作为疫苗，免疫动物后该载体会在体内表达抗原，继而刺激机体产生免疫反应和保护作用。DNA疫苗具有很多优点：生产工艺简单、产品易纯化、便于储存，在接种者体内表达抗原，并且能够产生体液免疫和细胞免疫反应，然而，DNA免疫原性较低，不足以提供足够的保护作用，距离真正的人类临床应用还有一定的差距，需要进一步提高与放大祼DNA的免疫效果。树突状细胞（DCs）是体内已知最强的专职抗原递呈细胞，在抗原递呈和启动机体免疫应答中具有十分重要的作用。DEC205是表达于树突状细胞表面的内吞性受体，能够高效地介导抗原的摄取、加工处理以及递呈。为了增强肉毒毒素 DNA疫苗的免疫原性，本研究开展了A型肉毒毒素受体结合区Hc抗原靶向DCs的DNA疫苗研究工作。将编码抗DEC205的抗体基因（scDEC）和编码 A型肉毒毒素受体结合区基因（AHc）融合，并克隆到真核表达载体pVAX1中，构建了一个DCs靶向的DNA疫苗（pVAX1-scDEC-AHc）,同时还设置了非靶向的疫苗载体（pVAX1-SAHc）和阴性对照（pVAX1）。免疫小鼠后证明该DCs靶向的DNA疫苗确实能够增强抗原特异性体液和细胞免疫反应；相比于非靶向 DNA疫苗，其抗体滴度增强了2.5倍，细胞免疫反应也有较大程度的增强。抗体亚型测定的结果表明该DNA疫苗免疫小鼠后产生了以IgG1为主的抗体，即免疫反应以Th2型免疫应答途径为主。保护性试验结果证明pVAX1-scDEC-AHc疫苗免疫后能够刺激机体产生强的保护性免疫反应，30μg剂量免疫两次之后即能对103 LD50的A型肉毒毒素产生完全保护作用，而pVAX1-SAHc疫苗仅为12.5％的保护效率；三次免疫之后对104 LD50的A型肉毒毒素具有87.5%的保护效率，pVAX1-SAHc疫苗仅为12.5%的保护效率，这些结果表明 pVAX1-scDEC-AHc DNA疫苗相对于pVAX1-SAHc疫苗具有更高的保护效率。通过脾细胞流式分析和免疫注射部位肌肉组织免疫组化实验研究了该 DNA疫苗的 DCs靶向效应，结果表明pVAX1-scDEC-AHc疫苗免疫后能够在免疫注射部位募集更多的DCs，促进其成熟，并且能够高效地促进免疫器官中的DCs进行增殖和成熟，这些结果提示该DNA疫苗能够增强免疫反应可能要归功于这种DCs靶向作用。
　　本研究工作还对原核表达的可溶性B型肉毒毒素重组亚单位疫苗的免疫原性进行了研究。本实验将B型肉毒毒素受体结合区Hc段基因克隆到pTIG-Trx原核表达载体，利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株实现了BHc的可溶性表达，破菌上清用HisTrapTM HP蛋白纯化柱和CaptoTM MMC层析柱进行纯化，纯化到了纯度较高的带His标签的和无His标签的BHc抗原。免疫小鼠研究该大肠杆菌表达的重组BHc的免疫原性和保护效果，结果表明1μg该重组BHc单剂量免疫小鼠就能对103 LD50的B型肉毒毒素产生完全保护作用，两次免疫则可以对104 LD50的B型肉毒毒素产生完全保护作用。测定BHc-His免疫的小鼠血清中特异性抗体滴度平均可以达到1:110000，血清中和效价可以达到3.33 IU/ml；BHc免疫的小鼠血清中特异性抗体滴度平均可以达到1:70000，血清中和效价可以达到2.33 IU/ml；而酵母表达的mBHc免疫组仅为1:40000和1.25 IU/ml；这些结果表明大肠杆菌表达的重组BHc-His抗原具有良好的免疫原性和保护效果。此外，对于没有His标签的BHc抗原的免疫原性研究结果表明其同样具有很好的保护效果，可以作为候选的B型肉毒毒素重组亚单位疫苗进行下一步研究与开发。
　　总结以上研究结果，在A型肉毒毒素Hc靶向DCs的DNA疫苗研究中证明了通过DEC205受体将抗原靶向到DCs的策略确实能够增强融合抗原免疫后的体液和细胞免疫反应，为增强 DNA疫苗的免疫原性提供了一个新思路，并为其他型肉毒毒素或者其他病原体 DNA疫苗的研究提供了新的技术平台。B型肉毒毒素重组亚单位疫苗的研究结果表明大肠杆菌表达的重组 BHc抗原具有良好的免疫原性和保护效果，可以作为一个候选单价疫苗，并与原核表达的A、E和F型重组Hc抗原配制四价肉毒毒素亚单位疫苗。

目录

声明

缩略词表

前言

1 肉毒毒素

2 预防性肉毒毒素疫苗研究进展

3 DCE205及其作用研究进展

4 本研究设计思路及研究内容

第一部分 重组Hc抗原靶向DCs的A型肉毒毒素DNA疫苗研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 B型肉毒毒素重组Hc亚单位疫苗研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

研究总结

参考文献

稿件录用函

论著:B型肉毒毒素重组Hc亚单位疫苗的免疫原性研究

个人简历

致谢