重组全长A型肉毒毒素突变体疫苗

摘要

本发明公开了一种重组全长A型肉毒毒素突变体疫苗。本发明提供的蛋白质，是如下1)或2)所述的蛋白质：1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，针对BoNT/A全长基因，选取轻链的影响其酶活性的关键氨基酸位点进行突变，使其无法与底物蛋白进行反应，从而制备出低毒或无毒且免疫原性好的重组全长肉毒毒素突变体疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组全长A型肉毒毒素突变体疫苗。

背景技术

肉毒毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的一种毒性极强的神经性毒素，引起以迟缓性肌麻痹为特征的中毒症状，病死率极高。根据抗原性不同，BoNT分为A～G7种血清型，各型结构相似，均以单一多肽链的形式被合成，经过内源或外源蛋白酶的作用形成以二硫键相连的双链形式：即具有毒素活性的轻链(LC)和具有结合、转位功能的重链(HC)。能导致人类中毒的这类毒素主要有肉毒毒素A型、B型和E型三种。由于该毒素制备和运输相对方便并且毒性强，也易被一些国际恐怖和极端组织所利用，一直以来都被美国CDC认为是具有高度危险性的能被用于生物恐怖的六大危险因子之一，也是重要的生物毒素战剂之一。由于该毒素蛋白分子量大、基因所含碱基中A、T含量高，且所选密码子多为稀有密码子，所以表达难度比较高。目前国内外的研究主要集中于使用福尔马林完全灭活的类毒素疫苗，如美国等国家储备有单价和多价的类毒素疫苗和多价马血清抗毒素，或者对全长的基因进行截断，单独选取一段轻链、重链的Hc1区或Hc2区进行表达，从而作为候选疫苗抗原。但这两种方法都有一定的局限性。前者使用福尔马林等试剂处理蛋白，会影响蛋白质抗原的免疫原性，并且其残留毒性问题也不容忽视；同时，人类对其还具有超免反应等副作用。此外，制备类毒素疫苗时存在危险性，特别是有些型别的肉毒梭菌菌株的产毒水平并不高，获得足够的毒素及其分离纯化和脱毒的过程很费人力、物力和时间。后者则只选取了全长基因的一部分，表达所获蛋白的抗原性有待提高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，人工合成，是如下1)或2)所述的蛋白质：

1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。

上述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。

所述编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

含有所述蛋白质的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。

所述重组载体为如下1)或2)：

1)所示的重组载体为将所述编码基因插入载体PMD-18T的多克隆位点间得到的重组载体；

2)所示的重组载体为将所述编码基因插入载体pJRC200的BstBI和Bsu36I识别位点间得到的重组载体。

所述重组菌为将所述表达载体导入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌具体为低毒产气荚膜梭菌ATCC3624。

扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对。

活性成分为上述的蛋白质或编码基因或重组载体或重组菌的疫苗也是本发明保护的范围。

所述蛋白质在制备疫苗中的应用，所述疫苗为类毒素疫苗，具体为全长肉毒毒素突变体疫苗，也为抗肉毒神经毒素的类毒素疫苗。

本发明的实验证明，针对BoNT/A全长基因，选取轻链的影响其酶活性的关键氨基酸位点进行突变，使其无法与底物蛋白进行反应，从而制备出低毒或无毒且免疫原性好的重组全长肉毒毒素突变体疫苗。

附图说明

图1为BoNT/A Lc的基因的PCR扩增结果

图2为pJRC200-BoNT/A质粒双酶切结果

图3为BoNT/A mLc的活性分析

图4为SDS-PAGE和Western blot分析

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用天然毒素，其为BoNT/A，氨基酸序列为序列4，为将A型肉毒梭菌(Clostridium botulinum)62a在TPYG培养基中35℃培养4天，收集菌液，离心取上清液，经过酸沉淀、PB抽提、硫酸铵沉淀、Sephacryl-200凝胶过滤、DEAE-Sepharose离子交换等步骤纯化，得到天然毒素。

实施例1、轻链突变体BoNT/A mLc和全长的突变体BoNT/A的获得

一、轻链突变体BoNT/A mLc的获得

1、轻链BoNT/A Lc的获得

从A型肉毒梭菌(Clostridium botulinum)62a(Smith T J，Lou J，et al. Sequence variation within botulinum neurotoxin serotypes impacts antibody binding and neutralization.Infect Immun，2005，73(9)：5450-5457.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)中提取基因组DNA(Genebank登录号为：M30196.1)。

以基因组DNA为模板，以上游引物：5’-CGggatccCCATTTGTTAATAAACAATT；和下游引物：5’-GTAAActcgagTGCCTTATTGTATCCTTT进行PCR扩增，结果得到1344bp的PCR产物，该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列3自5’末端第4-1344位核苷酸。

将该PCR产物连接到pMD-18T载体(Taraka公司产品，产品号：D101A)上，得到的连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，提取转化子的质粒，送交上海生工公司测序，结果表明该质粒为将序列表中的序列3自5’末端第4-1344位核苷酸插入pMD-18T载体得到的质粒，含有的PCR产物的核苷酸序列(序列3)与GenBank上所公布的A型肉毒梭菌62A标准株(登录号：M30196.1)序列一致性为100％，及该PCR产物的基因即为BoNT/A Lc，该基因编码的蛋白为BoNT/A Lc，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4的自5‘末端第2-448位氨基酸。

将该质粒命名为pMD-18T-BoNT/A Lc。

2、轻链突变体BoNT/A Lc突变体(BoNT/A mLc)的获得

以上述获得的pMD-18T-BoNT/A Lc为模板，使用QuikChange Lighting定点突变试剂盒对pMD18T-BoNT/A Lc质粒进行定点突变，得到获得了突变质粒。

将突变质粒送去测序，结果为该突变质粒中含有序列表中序列1自5’末端第4-1344位核苷酸所示的基因，将序列1自5’末端第4-1344位核苷酸所示的基因命名为BoNT/A mLc，该基因编码的蛋白命名为BoNT/A mLc，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2自5’末端第2-448位氨基酸，将该突变质粒命名为pMD18T-BoNT/A mLc。

比对蛋白BoNT/A mLc(序列2自5’末端第2-448位氨基酸)和BoNT/A Lc(序列4自5’末端第2-448位氨基酸)，结果为将序列4(BoNT/A Lc)的第351位的Glu突变为序列2(BoNT/A mLc)的第351位的Ala；序列4(BoNT/A Lc)的第363位的Arg突变为序列2(BoNT/A mLc)的第363位的Ala；序列4(BoNT/A Lc)的第366位的Tyr突变为序列2(BoNT/A mLc)的第366位的Phe；

比对基因BoNT/A mLc(序列1自5’末端第4-1344位核苷酸所示的核苷酸)和BoNT/A Lc(序列3自5’末端第4-1344位核苷酸所示的核苷酸)，结果为将序列3(BoNT/A Lc)的第1051-1053位的gag突变为序列1(BoNT/A mLc)的第1051-1053位的gcg；序列3(BoNT/A Lc)的第1087-1089位的aga突变为序列1(BoNT/A mLc)的第1087-1089位的gcg；序列3(BoNT/A Lc)的第1096-1098位的tat突变为序列1(BoNT/A mLc)的第1096-1098位的ttc。

也可人工合成序列1自5’末端第4-1344位核苷酸，将序列1自5’末端第4-1344位核苷酸连接在pMD18T上，也可以得到pMD18T-BoNT/A mLc。

3、重组载体的获得

将pMD18T-BoNT/A mLc经BamHI和XhoI酶切与经过同样酶切的pET32a载体(购自Novagen公司)连接，得到pET32a-mLc。

采用同样的方法将pMD-18T-BoNT/A Lc中的BoNT/A Lc与pET32a载体连接得到pET32a-Lc。

二、全长BoNT/A的获得

从A型肉毒梭菌62a中提取基因组DNA(Genebank登录号为：M30196.1)。

以基因组DNA为模板，以PA上游：CCGttcgaaATGCCATTTGTTAATAAACAATTTAATT

PA下游：CccttaggCAGTGGCCTTTCTCCCCATC进行PCR扩增，结果如图1所示，1-10均得到3888bp的PCR产物，该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸。

将该PCR产物连接到pMD-18T载体(Taraka公司产品，产品号：D101A)上，得到的连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，提取转化子的质粒，送交上海生工公司测序，结果表明该质粒为将序列表中的序列3插入pMD-18T载体得到的质粒，含有的PCR产物的核苷酸序列(序列3)与GenBank上所公布的A型肉毒梭菌62A标准株(登录号：M30196.1)序列一致性为100％，及该PCR产物的基因即为BoNT/A，该基因编码的蛋白为BoNT/A，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4。

将该质粒命名为pMD-18T-BoNT/A。

2、全长突变体BoNT/mA的获得

以上述获得的pMD-18T-BoNT/A为模板，使用QuikChange Lighting定点突变试剂盒对pMD-18T-BoNT/A质粒进行定点突变，得到突变质粒。

将突变质粒送去测序，结果为该突变质粒中含有序列表中序列1所示的核苷酸，将序列1所示的基因命名为BoNT/A，该基因编码的蛋白命名为BoNT/mA，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，将该突变质粒命名为pMD18T-BoNT/mA。

比对突变蛋白BoNT/mA(序列2)和BoNT/A(序列4)，结果为将序列4(BoNT/A Lc)的第351位的Glu突变为序列2(BoNT/A mLc)的第351位的Ala；序列4(BoNT/A Lc)的第363位的Arg突变为序列2(BoNT/A mLc)的第363位的Ala；序列4(BoNT/A Lc)的第366位的Tyr突变为序列2(BoNT/A mLc)的第366位的Phe；

比对基因BoNT/mA(序列1)和BoNT/A(序列3)，结果为将序列3(BoNT/A Lc)的第1051-1053位的gag突变为序列1(BoNT/A mLc)的第1051-1053位的gcg；序列3(BoNT/A Lc)的第1087-1089位的aga突变为序列1(BoNT/A mLc)的第1087-1089位的gcg；序列3(BoNT/A Lc)的第1096-1098位的tat突变为序列1(BoNT/A mLc)的第1096-1098位的ttc。

也可人工合成序列1，将序列1连接在pMD18T上，也可以得到pMD18T-BoNT/m A。

3、重组载体的获得

用BstBI、Bsu36I双酶切上述获得的pMD18T-BoNT/mA，得到目的片段与经过同样酶切得到的pJRC200载体(Czeczulin JR，Collie RE.Regulated expression of Clostridium perfringens enterotoxin in naturally cpe-negative type A，B，and C isolates of C.perfringens.Infect Immun，1996，64(8)：3301-3309.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)片段连接，得到的连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，提取转化子的质粒，用BstBI、Bsu36I双酶切，结果如图2所示，1-4分别为质粒，得到3888bp的片段为阳性质粒，将阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pJRC200载体的BstBI和Bsu36I酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为pJRC200-BoNT/mA。

采用同样的方法将序列表中的序列3插入pJRC200载体的BstBI和Bsu36I酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为pJRC200-BoNT/A。

实施例2、轻链BoNT/A mLc和全长BoNT/mA的功能验证

一、BoNT/A mLc和全长BoNT/mA的活性分析

将上述得到的pET32a-mLc和pET32a-Lc分别转入E.coli BL21(DE3)中，诱导加入IPTG至终浓度为1mM，25℃，120r/min水浴摇床振荡培养过夜，诱导培养产物4℃，6000r/min离心20min收集菌体。

破碎菌体离心取上清，经镍柱纯化后，分别得到突变的BoNT/A mLc蛋白和未突变的BoNT/ALc蛋白。

将BoNT/A Lc和BoNT/A mLc分别于毒素切割反应缓冲液按2∶1的比例于37℃孵育15min，再与SNAP-25蛋白(购自PROSPEC，货号：PRO-396，重组突触相关蛋白25kDa(Recombinant SNAP-25))在37℃下孵育1h，经SDS-PAGE电泳观察反应结果。

毒素切割反应缓冲液(pH 7.4)

HEPES                         50mM

DTT                           2mM

氯化锌                        10μM

均为常用试剂

结果如图3所示，A为BoNT/A Lc蛋白和SNAP蛋白作用，M：marker；1.30μl SNAP；2.30μlSNAP+5μl BoNT/A Lc；3.30μl SNAP+10μl BoNT/A Lc；4.30μl SNAP+15μl BoNT/A Lc；5.30μl SNAP+20μl BoNT/A Lc；6.30μl SNAP+25μl BoNT/A Lc；7.25μl Lc；B为BoNT/AmLc蛋白和SNAP蛋白作用，M：marker；1-30μl SNAP；2-30μl SNAP+25μl BoNT/A mLc；3-30μl SNAP+30μl BoNT/A mLc；4-30μl SNAP+35μl BoNT/A mLc；5-30μlSNAP+40μl BoNT/A mLc；6-30μl SNAP+45μl BoNT/A mLc；7-45μl BoNT/A mLc，可以看出，从图中可以看出，未经突变的BoNT/A Lc蛋白能够特异性的识别SNAP-25上的Q197-R198位点，对SNAP-25蛋白进行切割，并随着BoNT/A Lc蛋白的量的增加，出现一个梯度反应现象(SNAP-25被Lc切成一个20kD多和2，3kD的两条带，但是那个2，3kD的无法看出，图中30kD以下处出现的两条带，就是在1道中的SNAP-25被切开的现象，由于一开始Lc的量不多，所以不能完全切完)，而突变体蛋白BoNT/A mLc则完全无法识别该位点，不具有金属内肽酶活性。

从而证明通过定点突变，突变体蛋白BoNT/A mLc去除了毒素的毒力。

因为该毒素的主要活性中心就是轻链区表达的蛋白，只要轻链区失活，该毒素就无法识别人体的突触小体相关蛋白，从而无法阻止神经递质的释放，并引起肌肉麻痹的症状。突变体蛋白BoNT/A mLc去除了毒素的毒力，说明全长无毒力。

二、全长BoNT/mA蛋白的功能验证

1、全长BoNT/mA蛋白在产气荚膜梭菌表达系统中的表达及Western Blot分析

通过电击转化的方法将pJRC200-BoNT/mA转入低毒产气荚膜梭菌ATCC3624(产气荚膜梭菌拉丁文：Clostridium perfringers，记载在Czeczulin JR，Collie RE.Regulated expression of Clostridium perfringens enterotoxin in naturally cpe-negative type A，B，and C isolates of C.perfringens.Infect Immun，1996，64(8)：3301-3309.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)细胞中，得到重组菌。提取重组菌的质粒，送去测序，结果为该质粒为将pJRC200-BoNT/mA，将含有该质粒的重组菌命名为无毒产气荚膜梭菌ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA。将无毒产气荚膜梭菌ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA厌氧培养(37℃，8-12h，在厌氧罐中培养，培养基为MDS培养基)，将ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA离心取沉淀即为ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA芽胞体。将无毒产气荚膜梭菌ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA厌氧培养(37℃，8-12h，在厌氧罐中培养，培养基为FTG，购自美国BD公司)，将ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA离心取沉淀即为ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA繁殖体。

将上述获得的芽胞体和繁殖体进行SDS-PAGE和Western blot(一抗抗体为抗BoNT/A马血清，兰州生物制品所(目录号国药准字S10820127)；二抗抗体为HRP标记的兔抗马二抗(北京欣经科生物技术有限公司，产品目录号30408)分析。

结果如图4所示，M：标准蛋白Marker；1，3为ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA繁殖体；；2，4为ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA芽胞体；5为BoNT/mA(BoNT/A突变体，氨基酸序列为序列2)；从图中看出，ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA芽胞体得到150kD的蛋白，与预期BoNT/mA的大小一致。Western blot检测结果发现，BoNT/mA可以很好的被抗BoNT/A马血清识别，从而为下一步研制重组全长BoNT/mA口服疫苗的奠定了基础。

加入去离子水至总体积100mL，在(1.05kg/cm²)高压下，121℃蒸汽灭菌15min。10mL分装至15mL离心管中，用时加入茶碱，调至终浓度为200μg/mL。

各组分都是常用的，茶碱，淀粉和Na Thioglycollate购自SIGMA公司。

3、突变体蛋白BoNT/mA的免疫效价分析

采用灌胃法对BALB/c小鼠(军事医学科学院动物中心购买)进行免疫，具体实验如下：

1)攻毒检测

A、小鼠分组：取BALB/c小鼠50只，雌雄各半，4周龄。先称量小鼠体重，按体重组成雌雄对子，再将其随机分成5组，每组10只，雌雄各半，1-4组为实验组，分别使用不同的剂量进行免疫；5组为对照组(浓度为0.85％(质量百分含量)的生理盐水)。

B、免疫的方式为：取生长至OD浓度达2.0的ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA菌液1、2、4、8ml，12000rpm离心2min后收集芽胞体用0.5ml浓度为0.01M，pH7.2的PBS缓冲液重悬，得到芽胞体溶液。

按不同的剂量(1、2、4、8ml)芽胞体溶液对1-4组的小鼠进行灌胃，每两周免疫一次，共免疫四次，攻毒前7天加强免疫一次，从第一次免疫结束后的一周记作第一周。

对照组灌胃等体积的浓度0.85％的生理盐水(1个LD50相当于0.001μg/kg浓度生理盐水)。

C、加强免疫后第7天进行攻毒，先将天然毒素(BoNT/A，氨基酸序列为序列4，)用0.01M，pH7.2的PBS缓冲液稀释至2，5，10，50，100LD50，腹腔注射，0.5ml/只，观察4天，统计小鼠存活只数，结果见下表1所示。

表1  攻毒组小鼠存活只数

  2 LD₅₀  5 LD₅₀  10 LD₅₀  50 LD₅₀  100 LD₅₀ 1ml(1组)  10/10  4/10  5/10  0/10  0/10 2ml(2组)  10/10  5/10  6/10  0/10  0/10 4ml(3组)  10/10  10/10  8/10  0/10  0/10 8ml(4组)  10/10  10/10  10/10  2/10  0/10 阳性对照(5组)  0/10  0/10  0/10  0/10  0/10

注：存活只数/组只数

由上表可知，BoNT/mA蛋白免疫原性良好，对小鼠有保护作用。

2)效价检测

取BALB/c小鼠20只，雌雄各半，4周龄。用ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA芽胞体对其进行免疫(免疫方法同上)，分别在第14天(2周)、28天(4周)、42天(6周)取小鼠的尾血清。

取20只小鼠尾血混合后，间接ELISA测定血清效价，具体如下：将天然毒素(BoNT/A)用包被液稀释至8μg/ml，加入酶联孔，100μl/孔，4℃过夜。次日，吸出孔内液体，用PBST(0.01M，0.5％Tween，pH7.2)洗板三遍，在加入3％BSA，150μl/孔，37℃孵育1h后弃孔内液体，重复洗板步骤。将血清梯度稀释1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000，100μl/孔，并设好阴性对照，37℃孵育1h。洗板后加入稀释好的酶标二抗(羊抗鼠IgG，北京欣经科生物技术有限公司，产品目录号30409)，100μl/孔，37℃孵育1h后洗板显色，于波长450nm测定A值。A值大于阴性均值2倍考虑为阳性结果。四免后血清效价可达104，具体如表2所示。

表2  为血清效价

 2周  4周  6周  血清效价 100  1000  10000

3)中和实验

取BALB/c小鼠50只，分组方法同1)中的A，分为5组，1-4组为实验组，第5组对照组。

先将天然毒素(BoNT/A)按20，100，200，2000LD₅₀梯度稀释(毒素的半数致死量是LD₅₀，按一个LD₅₀的20，100，200，2000倍稀释天然肉毒毒素，一个LD₅₀就是基础的单位)然后将ATCC3624/pJRC200-BoNT/mA芽胞体免疫小鼠后的血清与等体积天然毒素溶液(溶剂为PBS，溶质为天然毒素(BoNT/A)，溶质在溶液中的浓度为1mg/ml)混合，使终浓度为10，50，100，1000LD₅₀，37℃温育1h后注射小鼠，作为实验组，观察4天，统计小鼠存活情况。

将浓度为0.85％的生理盐水免疫小鼠后的血清与等体积天然毒素溶液混合，使终浓度为10，50，100，1000LD₅₀，37℃温育1h后注射小鼠，作为对照组。

结果见下表3(如：10/10表示全活，8/10表示10只死了8只)

表3  中和毒素实验结果

  1d  2d  3d  4d  10 LD₅₀  10/10  10/10  10/10  10/10  50 LD₅₀  10/10  10/10  10/10  10/10  100 LD₅₀  10/10  10/10  10/10  10/10  1000 LD₅₀  8/10  6/10  5/10  5/10  阴性对照  0/10  0/10  0/10  0/10

注：活/总

从表2中可以看出，免疫血清具有良好的中和毒素的作用。