全长A型肉毒毒素突变体构建及其在产气荚膜梭菌系统中表达的研究

摘要

肉毒神经毒素（botulinum neurotoxin, BoNT)是一种大分子的毒性蛋白，根据其抗原性的不同，可分划为A～G 7种血清型。每型BoNT均由一条单一多肽链组成，分子量约为150KDa，在结构上分为两部分：轻链（Lc，50kDa）为活性结构域，具有锌依赖性金属内肽酶活性；重链（Hc，100kDa）为结合和转位结构域。由于BoNT的中毒剂量小，潜伏期短，致死率高，已成为最具威胁的生物恐怖剂之一。所以，发展BoNT疫苗对预防肉毒中毒，以及应对生物恐怖袭击具有重要的医学意义。
　　 首先，为了评价BoNT/A Lc突变体蛋白的活性，我们克隆、表达了BoNT/A Lc的作用底物SNAP-25蛋白。将本室保存的pET22b-SNAP25质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，25℃，120r/min水浴摇床振荡培养过夜，采用终浓度为1mM的IPTG诱导表达，表达产物经过SDS-PAGE电泳分析。结果表明，目的蛋白在上清和包涵体中均有分布，为了保证SNAP-25的生物学活性，我们采用了上清中的蛋白来进行下一步的活性分析实验。
　　 其次，利用实验室已构建的含有BoNT/A Lc目的基因片段的质粒pET-32a-Alc，采用定点突变技术，对BoNT/A Lc中Arg362、Tyr365和Glu350三个关键性的氨基酸位点进行了突变，获得了BoNT/A Lc的突变体。采用低温诱导，表达融合蛋白的方法，成功获得了可溶性的BoNT/A Lc及其突变体蛋白。通过该突变体与BoNT/A底物蛋白SNAP-25的切割反应，发现未经突变的BoNT/A Lc蛋白能够特异性的识别SNAP-25上的Q197-R198位点，而突变体蛋白则完全无法识别该位点，不具有金属内肽酶活性，从而证明通过定点突变，我们成功的去除了毒素的毒力，为下一步的全长BoNT/A重组疫苗的研究打下了基础。
　　 最后，为有效表达全长BoNT/A大分子抗原，本实验选用了与肉毒梭菌同属的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)表达系统。先以肉毒梭菌的DNA为模板，通过PCR的方法扩增全长3901bp的BoNT/A基因，并克隆至T载体得到pMD18T-BoNT/A载体，核苷酸序列测定结果表明，与GenBank上所公布的A型肉毒梭菌62A标准株（登录号：M30196.1）序列一致性为100%。然后以pMD18T-BoNT/A载体为模板，按前述方法进行定点突变（Arg362Ala、Tyr365Phe、Glu350Ala）, 经测序分析正确后，经BstBI、Bsu36I双酶切将全长BoNT/A突变体基因连接到pJRC200载体中，再通过电击转化的方法转入低毒产气荚膜梭菌ATCC3624细胞中，进行厌氧培养表达目的蛋白。用SDS-PAGE和Western blot分析，发现BoNT/A突变体蛋白在产气荚膜梭菌芽孢体中大量表达，而在繁殖体中没有表达，表达出的BoNT/A突变体蛋白可以很好的被抗BoNT/A马血清识别，从而为下一步研制重组全长BoNT/A口服疫苗的奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

第一章文献综述

第二章A型肉毒毒素底物SNAP-25蛋白的表达与纯化

第三章重组A型肉毒毒素轻链突变体构建、表达及活性鉴定

第四章全长A型肉毒毒素突变体构建及其在产气荚膜梭菌系统中的表达与分析

结论

参考文献

附录

致谢

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