根癌农杆菌转化杜仲的初步研究

摘要

杜仲(Eucommia Ulmoides Oliv.)是我国特有的经济树种，也是世界上适应范围最广的重要胶源植物。我国杜仲资源丰富，在我国暖温带的26个省(区、市)均有栽培。杜仲皮是我国特有的中药的出口创外汇物资，具有强筋骨、补肝肾、久服轻身耐老等作用，为中药上品。其树干通直、树形优美，根系发达、生长迅速，抗逆性强、病虫害少，是丘陵、山区和平原山区良好的特有经济树种。杜仲中除含有大量杜仲胶外，还含有多种药用活性成分，例如绿原酸，松脂醇二葡萄糖苷等其他降压活性成分。杜仲为第四冰川“活化石”，是名贵补益药材，《神农本草经》中被列为上品，曾记载杜仲的药效，具有性微干、微辛、补中益精气、坚筋骨、强志、益腰膝、除酸痛、除阴下痒湿、久服轻身耐劳之功效。杜仲的果皮、树皮、叶片内都含有杜仲胶，杜仲胶是我国十分宝贵的天然橡胶资源。由于杜仲胶高弹体所独具的橡塑二重性和形状记忆等特殊功能，它被广泛地用于交通、通讯、医疗、电力、国防、水利、建筑和人们的日常生活中，产业化前景十分广阔。 本试验研究了杜仲组织培养的条件对杜仲愈伤组织含胶量的影响，设计出一套以杜仲愈伤组织及外植体为原料，从中获得绿原酸，松脂醇二葡萄糖苷等药用成分以及杜仲胶的综合提取工艺。实验初步建立了利用根癌农杆菌转化杜仲的方法，得到含有冠瘿瘤的愈伤组织，以此来增加杜仲愈伤组织的生长速度，并考查了悬浮培养对愈伤组织的增殖效应的影响，为杜仲胶及杜仲愈伤组织中的次生代谢产物的提取提供了大量的原料物质。主要取得如下研究成果： 1．分别利用真叶，子叶，茎以及根，四种外植体在添加有激素的MS培养基上诱导愈伤组织，通过对愈伤组织的观察确定外植体。 2．将MS培养基上诱导的愈伤组织接种于附加不同浓度的NAA和6-BA的B<,5>培养基上，进行不同激素添加量对愈伤组织的增殖效应影响的研究。 3．悬浮培养对愈伤组织增殖以及对愈伤组织胶含量的影响。 4．设计一套杜仲愈伤组织中杜仲胶及药用成分综合提取工艺路线，成功的提取到杜仲胶，绿原酸以及松脂醇二葡萄糖苷，证明综合提取方案可行。 5．用整体透明及藩红．固绿染色法结合法，观察杜仲愈伤组织含胶细胞形态； 6．初步探讨得出根癌农杆菌转化杜仲愈伤组织的方法：结合叶盘转化法和整株感染法两种方法为一体的新的转化方法，即将根癌农杆菌稀释菌液，用灭菌后的微量进样器吸取微量菌液，注入到杜仲愈伤组织，得出新的愈伤组织，并能够在不含激素的MS培养基上继代生长，即证明根癌农杆菌上含有能够激活杜仲体内激素合成的片断，已经整合到杜仲愈伤组织细胞中。

目录

文摘

英文文摘

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第一章绪论

1.1杜仲简介

1.1.1杜仲的起源与分布

1.1.2杜仲中化学成分

1.1.3杜仲应用现状

1.1.4.杜仲应用存在的问题

1.2植物转化的研究现状

1.2.1转化方法概述

1.2.2植物转化的应用及存在的问题

1.3根癌农杆菌介导植物转化研究

1.3.1农杆菌介导转化的研究机理及方法

1.3.2农杆菌介导转化的研究现状

1.3.3农杆菌介导转化木本植物在生产中的应用

1.4课题的背景、目的和主要内容

1.4.1课题的背景

1.4.2本课题研究的目的

1.4.3课题主要研究内容

第二章杜仲愈伤组织培养与继代

2.1试验仪器、试剂及材料

2.1.1设备与试剂

2.1.2材料

2.2基本操作

2.2.1培养基的制备

2.2.2培养基以及各试验器材的灭菌

2.2.3培养条件

2.2.4培养基母液的配置

2.3试验方法

2.3.1杜仲无菌幼苗的获得

2.3.2愈伤组织诱导研究与继代培养

2.3.3愈伤组织悬浮培养

2.3.4愈伤组织胶含量的测定

2.3.5杜仲愈伤组织含胶细胞形态观察——整体透明法

2.4结果与分析

2.4.1杜仲愈伤组织的诱导与继代

2.4.2培养基中激素添加量对愈伤组织的继代培养影响

2.4.3愈伤组织的悬浮培养与继代

2.4.4悬浮愈伤组织胶含量的测定

2.4.5杜仲愈伤组织含胶细胞的形态观察

2.5本章小结

第三章愈伤组织中杜仲胶及药用成分综合提取

3.1设备与材料

3.2综合提取流程

3.2.1工艺路线

3.2.2基本操作步骤

3.3目的产物检测方法的建立

3.3.1绿原酸的鉴定

3.3.2松脂醇二葡萄糖苷的鉴定

3.3.3杜仲胶的鉴定

3.4综合提取试验方案

3.4.1绿原酸的分离提取

3.4.2松脂醇二葡萄糖苷的分离提取

3.4.3杜仲胶的分离提取

3.5结果与分析

3.5.1绿原酸的测定

3.5.2松脂醇二葡萄糖苷的测定

3.5.3杜仲胶的测定

3.6本章小结

第四章根癌农杆菌介导转化杜仲遗传体系的初步建立

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1农杆菌的培养与保存

4.2.2转化体系的建立

4.2.3农杆菌介导转化杜仲

4.3结果与讨论

4.3.1农杆菌有效抑制问题

4.3.2菌液浓度与浸染时间的确定

4.3.3选择压强度问题

4.3.4预培养时间确定

4.3.5共培养时间确定

4.3.6转化结果

4.3.7转化情况的检测

4.4本章小结

第五章结论与展望

5.1结论

5.2展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文