欧洲型与美洲型PRRSV特异N蛋白表位基因表达及ELISA抗体检测方法的建立

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的一种病毒性传染病。该病毒分为两个型：欧洲型(以Lelystad Virus株为代表)和美洲型(以ATCC VR-2332株为代表)，两者存在一定的抗原差异性。成功实现了美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位基因在大肠杆菌中的表达，并对重组蛋白进行了纯化，利用纯化的重组蛋白初步建立了PRRSV抗体检测间接ELISA方法。 1.将针对美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位基因的重组质粒pGEX-6P-1-N与PQE30-N分别转化到表达宿主菌BL21(DE3)与M15中，经终浓度为1mmol/L的IPTG37℃诱导5h，分别高效表达了美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段即重组蛋白GST-N与HIS-N。western-Blot结果表明两种蛋白可分别被美洲型和欧洲型PRRSV阳性血清所识别，具有良好的反应原性。 2.利用表达的重组融合蛋白作为抗原，分别建立了检测美洲型和欧洲型PRRSV抗体的间接ELIsA方法，确定了GST-N抗原的最适包被浓度为4.5ug/ml，最适包被条件为37℃1h 4℃过夜，以1％BSA作为封闭液，检测血清稀释度为1：40，HRP-兔抗猪IgG的最适工作浓度为1：1000；代检血清与酶标二抗均为37℃作用30min。确定阴阳性临界值为0.43。初步组装的试剂盒进行现地血清的检测应用，与武汉科前ELIsA试剂盒的符合率达93.2％。HIS-N抗原的最适包被浓度为8ug/ml，最适包被条件为37℃1h 4℃过夜，代检血清按1：40稀释，37℃作用60min。HRP-兔抗猪IgG的最适工作浓度为1：1000，37℃作用30min。包被的重组蛋白均不与猪瘟、猪伪狂犬病、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒的阳性血清发生交叉反应，表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性。美洲型和欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立为我国进行PRRS抗体的监测和流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：缩略语及符号

声明

文献综述猪繁殖与呼吸综合征的研究进展

试验一：美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位基因表达及其产物的纯化

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4小结

试验二：欧洲型和美洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4小结

结论

参考文献

致谢