美洲型及欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种高度接触传染性病毒,妊娠母猪以及仔猪被感染后各自表现为繁殖障碍以及严重呼吸道疾病,给养猪业造成巨大的经济损失。当前,PRRS V临床流行毒株既有美洲型高致病性变异毒株、经典毒株,又有欧洲型毒株,并且流行毒株基因组仍在持续变异之中,给临床诊断造成极大的困难,亟需建立快速、特异的PRRSV鉴别检测方法。
　　1.美洲型和欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用
　　根据GenBank中发表的PRRSV美洲型经典株VR-2332株、变异株JXA1以及欧洲型LV株的基因组序列差异,利用P rimer Exp ress3.0软件包设计合成了3条T aq Man探针和2对特异性引物。经过反应条件的优化,建立了能同时检测PRR SV美洲型变异株、经典株以及欧洲型毒株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数都达到0.999以上;敏感性高,检测下限为2.68拷贝/μL,比普通RT-PCR敏感100倍;组内及组间变异系数均小于1.5％,具有较好的重复性;特异性强,只能特异的扩增PR RS V,而与猪的其他常见病毒无交叉反应。应用所建立多重T aq Man荧光定量RT-PCR方法,对282份疑似PPRS临床样品进行检测,结果显示,共检测到101份PRRS V阳性,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。
　　2.PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量R T-PCR鉴别检测方法的建立及应用
　　针对PRR S V美洲型经典株、变异株以及弱毒活疫苗T JM-F92株的基因序列差异,利用Primer Express3.0软件包设计了3条TaqMan探针和2对特异性引物,经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分 PR RS V美洲型变异株、T JM-F92疫苗株及经典株的多重T aq Man荧光定量RT-PCR方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,与猪的其他常见病毒无交叉反应;经典株、变异株、T JM-F92疫苗株重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL,比常规P CR敏感100倍;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。此外,该方法对324份疑似PP RS临床样品进行检测,结果PR RS V阳性114份,其中美洲型变异株105份、经典株6份、T JM-F92疫苗株3份,变异株和经典株混合感染4份。
　　3.CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用
　　本研究根据猪瘟病毒(CSFV)以及PRRSV的基因序列差异,利用Primer Express3.0软件包设计了3条特异性TaqMan探针和3对特异性引物,对反应条件进行反复优化,建立了能同时检测并区分C SF V以及PRRS V美洲型毒株、欧洲型毒株的多重T aq Man荧光定量RT-PC R方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,与猪的其他常见病毒无交叉反应;检测下限为2.68拷贝/μL;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。应用该方法对253份临床疑似样品进行检测,结果病原阳性106份,其中20份为CSFV阳性,86份为美洲型PRRSV阳性,11份为CSFV和美洲型PRRSV混合感染,未检测到欧洲型PRR SV。
　　综上所述,本研究成功建立了3种PRRS V的鉴别检测方法,一是同时检测并区分美洲型和欧洲型PR RS V的多重T aq Man荧光定量RT-PCR方法,二是同时检测并区分PRR S V美洲型经典株、变异株和T JM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法,三是同时检测并区分CSFV及美洲型、欧洲型PRRS V的多重T aq Man荧光定量RT-PCR方法,为P RRS V的快速鉴别检测及流行病学调查提供了有效的技术平台。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 综述

1. 1猪繁殖与呼吸综合征综述

1. 2猪瘟概述

1. 3研究目的及意义

1. 4技术路线

第二章 同时检测美洲型、欧洲型P RRSV多重TaqMa n荧光定量RT-P CR方法的建立及应用

2. 1实验材料

2. 2实验方法

2. 3结果

2. 4讨论

第三章 同时检测P RRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F 92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-P CR方法的建立及应用

3. 1实验材料

3. 2实验方法

3. 3结果

3. 4讨论

第四章 同时检测美洲型、欧洲型P RRSV以及CSF V多重

4. 1实验材料

4. 2实验方法

4. 3结果

4. 4讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文及专利情况

申明