欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法

摘要

本发明提供一种鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的血清学方法，该方法是针对美洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7蛋白的1～23和59～259氨基酸序列，建立美洲型PRRSV Nsp7蛋白的原核重组表达载体pET-32a-JXA1-ΔNsp7；针对欧洲型PRRSV Nsp7蛋白表位1～23和59～269氨基酸序列，建立欧洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7的原核重组表达载体pET-32a-LV-ΔNsp7。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。利用经镍柱亲和纯化的美洲型Nsp7蛋白作为包被抗原制备用于美洲型PRRSV抗体检测的间接ELISA诊断试剂盒；以纯化的欧洲型Nsp7蛋白作为包被抗原，优化了欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法；两种试剂盒的发明可用于PRRSV抗体的分型检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域内的动物疾病诊断技术，以PRRSV JXA1株和LV株的相似的抗原表位24aa～58aa缺失的Nsp7基因表达蛋白作为抗原，建立了一种鉴别欧、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法。

背景技术

按照2005年国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第八次报告，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Procine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)在分类上属动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus)。根据各分离株的序列分析及血清学试验结果将PRRSV分为两个型分别为欧洲型(代表毒株为LV)和北美洲型(代表毒株为VR2332)，前者主要流行于欧洲地区，后者主要流行于美洲和亚太地区。

1987年该病首次在美国的衣阿华、北卡罗纳等州暴发，并在全美迅速蔓延，随后在短短的几年，迅速遍及全球各养猪业发达的国家和地区。1991年荷兰中央兽医研究所用猪肺泡巨噬细胞首次分离到病原，并命名为Lelystad病毒(PRRSV欧洲型代表株)；1992年美国研究人员用CL2621细胞也分离到PRRSV(美洲型代表株VR2332)。1996年，哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似PRRS病例中分离到PRRS病毒，从而证实了本病在我国的存在。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为主要特征。该病几乎在所有的国家流行，严重影响养猪业的发展。

我国在2006年春夏交接之际，南方地区发生了以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病，而后迅速蔓延至周边地区，至2007年已遍及全国绝大部分省份，对我国养猪业造成巨大损失，涉及十几个省的2000000头猪发病，且造成400000头猪死亡。2007年1月，农业部最终确定“高热病”即“高致病性蓝耳病”。

同时，欧洲型PRRSV在我国的发生也已有报道，并从浙江宁波地区和福建地区的临床发病猪场中检测到了欧洲型PRRSV，其部分序列在GenBank中的登录号为EF473138和EF592535，该序列与疫苗株AMERVAC-PRRS/A3弱毒疫苗株序列的同源性较高。欧洲型PRRSV弱毒疫苗的使用增加了国内PRRSV流行的复杂性，而且在自然界中还有可能发生病毒重组，我们实验室于2009年分别在内蒙和北京分离到两株欧洲株(登录号：GU047345和GU047344)。两者与LV株的同源性分别为87.01％，91.48％。

目前，对猪蓝耳病的预防和控制是世界各国面临的难题，为了更好的预防和控制本病的发生和流行，当务之急是要建立一种可靠的、适于大规模诊断与检测PRRS的方法。PRRS感染常用的分型诊断方法包括建立在免疫学基础和基因差异基础上。在免疫学基础上，有文献记载可以利用针对M蛋白的单抗建立的可鉴别NA-PRRSV和EU-PRRSV的间接免疫荧光技术，但无商品化的试剂盒；以分子生物学为基础的诊断主要依据PRRSV的ORF5、ORF6、ORF7和3’NCR等在NA-PRRSV和EU-PRRSV之间同源性较低差异显著的基因片段建立的基因分型技术，方法包括常规RT-PCR、PCR-RFLP、荧光定量RT-PCR等，如由中国动物疫病预防控制中心研制、北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的鉴别NA-PRRSV和EU-PRRSV的荧光定量RT-PCR试剂盒。但是这些诊断方法在应用中需要特殊的仪器和设备、耗时长、工作量大，已不能满足当前诊断PRRS感染的需要，特别是不适合大规模的临床样品检测与开展流行病学调查。

本研究在Nsp7蛋白的基础上剔除了欧洲型和美洲型PRRSV型间的相似的抗原表位，利用原核表达的融合蛋白作为抗原，建立一种适用于大规模检测PRRSV抗体的鉴别间接ELISA方法，以期为我国PRRSV型间抗体的鉴别提供一种快捷的技术手段。

发明内容

本发明的目的是研制一种能够区分欧洲型、美洲型的PRRSV抗体检测试剂盒，最终为大规模的临床样品的检测与开展流行病学调查提供ELISA检测方法。

本发明专利是通过以下技术方案实现的：

(1)抗原表位的计算机筛选：运用计算机软件(DNAMAN，DNAStar等)对猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp7基因进行同源性分析。抗原表位的筛选主要通过DNAStar(Madison，Wisconsin，USA)和DNAMAN软件对欧洲型、美洲型PRRSV的非结构蛋白Nsp7进行分析分别得到10个和12个多肽，经分析发现美洲型PRRSV Nsp7基因的部分抗原表位(JXA1：38-GQFIEAAYAKALRIELAQLVQVDKV-62，23-DFKCFVSA-30)与欧洲型PRRSV的非结构蛋白Nsp7的部分抗原表位(LV：38-GQYIEAAYAKALRQELASLVQID-60，23-NFKCFVSAS-31)相似。

(2)目的基因的扩增及表达载体的构建

针对美洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7蛋白表位1～23及59～259的氨基酸序列的原核重组表达载体pET-32a-JXA1-ΔNsp7；针对欧洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7蛋白表位1～23及59～269的氨基酸序列的原核重组表达载体pET-32a-LV-ΔNsp7。

(3)目的蛋白的表达及纯化：

在表达菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达。通过使用最佳的诱导表达的时间、诱导的温度和诱导剂的浓度，获得重组融合蛋白JXA1-ΔNsp7，LV-ΔNsp7。采用亲和层析的方法对表达的重组融合蛋白进行纯化。

(4)重组蛋白的免疫反应活性分析：Western-blotting试验

分别用欧、美洲型PRRSV的标准阳性血清作为一抗，做免疫印迹分析，经Western-blotting鉴定重组蛋白的特异性，见图5～8。

(5)欧洲型、美洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立

利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV ΔNsp7分别建立间接ELISA方法，确定美洲型ΔNsp7蛋白抗原包被浓度为0.5ug/ml，欧洲型ΔNsp7蛋白抗原包被浓度为0.5ug/ml；抗原包被条件均为37℃包被1h加4℃过夜；血清的稀释度和反应时间均为1∶80，1h；使用5％的脱脂奶粉封闭，封闭时间均为1h，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度和反应时间均为1∶35000，1h；常温下，底物反应时间为10min。针对美洲型PRRSV ΔNsp7蛋白的样本的阴阳性临界值为0.35，即当样本OD₄₅₀≥0.35，判定为阳性；当样本OD₄₅₀＜0.35，判定为阴性；针对欧洲型PRRSV ΔNsp7蛋白的样本的阴阳性临界值为0.4，即当样本OD₄₅₀≥0.4，判定为阳性；当样本OD₄₅₀＜0.4，判定为阴性；在验证该ELISA方法的特异性发现：两者皆不与CSFV、PRV、JEV、PPV阳性血清发生交叉反应和阻断试验结果显示随血清稀释倍数的增加，经阻断的阳性血清与阴性血清OD₄₅₀值逐渐接近，当血清稀释到640～1280倍时，达到完全阻断，表明建立的间接ELISA方法是特异的，且重复性很好；美洲株血清样品检测时，与法国LSI试剂盒进行比较，其敏感性和特异性分别是90％和94.2％，说明两种检测方法无显著性差异。

附图说明：

图1PRRSV-JXA1-Nsp7和PRRSV-LV-Nsp7上、下游基因片段的扩增：

1～4分别为JXA1-PRRSV-Nsp7上游(103bp)；LV-PRRSV-Nsp7上游(103bp)；JXA1-PRRSV-Nsp7上游(636bp)；LV-PRRSV-Nsp7上游(668bp)。

图2PRRSV-JXA1-ΔNsp7和PRRSV-LV-ΔNsp7基因片段构建：1：JXA1-PRRSV-ΔNsp7(672bp)；2：LV-PRRSV-ΔNsp7(702bp)。

图3表达载体pET-32a-JXA1-ΔNsp7和pET-32a-LV-ΔNsp7的鉴定：1～4：PCR扩增JXA1-PRRSV-ΔNsp7；表达载体pET-32a-JXA1-ΔNsp7的双酶切；PCR扩增LV-PRRSV-ΔNsp7；表达载体pET-32a-LV-ΔNsp7的双酶切。

图4重组融合蛋白JXA1-ΔNsp7和LV-ΔNsp7的诱导表达：SDS-PAGE鉴定：

1～2：重组融合蛋白LV-ΔNsp7；重组融合蛋白：JXA1-ΔNsp7。

图5：重组融合蛋白JXA1-ΔNsp7的免疫反应活性分析-Western-blotting鉴定(一抗为：美洲株标准血清)1～4：融合蛋白JXA1-ΔNsp7上样量分别为：20ul、15ul、10ul、5ul。

图6：重组融合蛋白LV-ΔNsp7的免疫反应活性分析-Western-blotting鉴定(一抗为：美洲株标准血清)1～4：融合蛋白LV-ΔNsp7上样量分别为：20ul、15ul、10ul、5ul。

图7：重组融合蛋白LV-ΔNsp7的免疫反应活性分析-Western-blotting鉴定(一抗为：欧洲株标准血清)1～4：融合蛋白LV-ΔNsp7上样量分别为：20ul、15ul、10ul、5ul。

图8：重组融合蛋白JXA1-ΔNsp7的免疫反应活性分析-Western-blotting鉴定(一抗为：欧洲株标准血清)1～4：融合蛋白JXA1-ΔNsp7上样量分别为：20ul、15ul、10ul、5ul。

具体实施方式

下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。

本发明首先参考已发表的关于PRRSV非结构蛋白Nsp7免疫反应的相关研究报道，利用计算机软件对欧洲型与美洲型PRRSV的抗原表位进行分析，分别设计两对引物，利用PCR方法克隆了PRRSV JXA1株(EF112445)和LV株(AY588319)的非结构蛋白Nsp7基因中欧洲型、美洲型毒株的相似抗原表位24aa～58aa缺失的部分，利用限制性内切酶将目的片段和原核表达载体pET-32a进行酶切，T4连接酶连接，获得构建原核表达载体，分别命名为：pET-32a-JXA1-ΔNsp7，pET-32a-LV-ΔNsp7。

用pET-32a-JXA1-ΔNsp7，pET-32a-LV-ΔNsp7分别转化受体菌BL21(DE3)，获得单个菌落，用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导，并在不同时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实ΔNsp7基因的表达，并确定IPTG的最佳诱导浓度及诱导时间分别为1mM和3.5小时。将SDS-PAGE后的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上进行Western-blotting试验，证实了所表达的重组蛋白大小相符具有免疫反应活性，且无交叉反应。通过对其特异性、敏感性及工作条件的优化试验，建立了鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法。

实施例1

抗原表位的计算机筛选

利用计算机软件(DNAMAN，DNAStar等)对猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp7基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性分析。美洲株JXA1(EF112445)和VR2332(AY150564)在氨基酸和核苷酸方面的同源性分别为：89.8％，90.0％；欧洲株之间在氨基酸和核苷酸方面的同源性均在90％以上；美洲株和欧洲株在氨基酸和核苷酸方面的同源性分别为：50.3％，47％。

表1猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7基因在核苷酸水平的同源性比较

表2猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7基因在氨基酸水平的同源性比较

抗原表位的筛选主要通过DNAStar(Madison，Wisconsin，USA)和DNAMAN软件对欧洲型、美洲型PRRSV的非结构蛋白Nsp7进行分析分别得到10个和12个多肽，经分析发现美洲型PRRSV Nsp7基因的部分抗原表位(JXA1：38-GQFIEAAYAKALRIELAQLVQVDKV-62，23-DFKCFVSA-30)与欧洲型PRRSV的非结构蛋白Nsp7的部分抗原表位(LV：38-GQYIEAAYAKALRQELASLVQID-60，23-NFKCFVSAS-31)相似。故将欧、美洲型毒株的相似的保守表位24aa～58aa基因缺失，缺失后美洲株和欧洲株在氨基酸和核苷酸方面的同源性分别为：43.78％，36.17％，为PRRS抗体分型检测降低非特异性反应打下基础。

实施例2

目的基因的扩增及表达载体的构建

2.1实验试剂

DNA Polymerase、限制性酶BamH I、限制性酶EcoR I、限制性酶Hind III、酶切缓冲液10×M Buffer、酶切缓冲液10×H Buffer以及DL2000Marker购自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs购自Promega公司；E.Z.N.Gel Extraction Kit、DNA胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；

高效大肠杆菌感受态细胞Trans-T1购自北京全式金生物技术有限公司；

引物合成和序列测序均由上海英骏生物工程技术服务有限公司完成；

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2.2实验仪器

TGRANDIENT PCR仪：购自HYBAID公司；

DYFIII2型电泳仪：购自Bio-Rad公司；

UVP凝胶成像分析系统：购自Gene公司；

Steril生物安全柜：购自BAKER公司；

恒温水浴锅：购自pHaramacia公司；

恒温培养箱：购自Kendro公司。

2.3实验毒株和载体

高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒株：2006年分离株JXA1、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒LV和表达载体pET-32(a)。以上病毒和载体均由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供。

2.4实验步骤

2.4.1猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1和LV株)Nsp7基因的扩增引物序列及酶切位点的设计

针对PRRSV JXA1株(EF112445)和LV株(LV4.2.1 AY588319)的Nsp7基因中欧洲型、美洲型毒株的相似的保守表位24aa～58aa基因缺失，设计引物：

表4猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1和LV株)Nsp7基因的扩增体系

首先分别将JXA1-Nsp7-F1R1，JXA1-Nsp7-F2R2；LV-Nsp7-F3R3，LV-Nsp7-F4R4作为引物进行RNA反应体系扩增，反应条件：42℃1h，94℃5min，94℃1min，56℃40s，72℃1min，30个循环次数，72℃延伸10min，4℃保存。将PCR产物进行胶回收回收。分别用JXA1-Nsp7-F1R2和LV-Nsp7-F3R4作为引物，以胶回收产物作为模板进行DNA反应体系扩增，反应条件：94℃5min，94℃1min，56℃40s，72℃1min，30个循环次数，72℃延伸10min，4℃保存。

2.4.2将扩增得到的JXA1-ΔNsp7、LV-ΔNsp7核苷酸片段和原核表达载体pET-32(a)进行酶切，酶切体系：限制性内切酶各2ul，10×Buffer 2ul，DNA或质粒13ul，最后用水补充至30ul，酶切大约4～5小时，进行电泳，胶回收。

2.4.3将回收得到的酶切后的基因JXA1-ΔNsp7和LV-ΔNsp7分别连接到进行同样处理的pET-32(a)表达载体上(20μL连接体系：6μL基因扩增产物，pET-32(a)表达载体，1μL T4DNA连接酶，2μL T4 DNA连接缓冲液，加水至20ul，16℃过夜)，然后将连接产物转化到Trans-T1感受态细胞。

2.4.4原核表达重组质粒的鉴定：通过PCR扩增，双酶切鉴定，序列测序等方法对构建好的质粒进行鉴定。结果见图3，最终得到构建好的原核表达载体：pET-32a-JXA1-ΔNsp7，pET-32a-LV-ΔNsp7。

实施例3

重组表达菌(含质粒pET-32a-JXA1-ΔNsp7，pET-32a-LV-ΔNsp7)的诱导表达

3.1实验试剂

Blue Plus Protein Marker(16kDa-94kDa)、表达用大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司

3.2实验仪器

HZQ-Q全温振荡器：购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司；

Mini-PROTEAN蛋白垂直电泳仪：购自BIORAD公司；

VCX-400超声裂解仪：购自Amersham pHarmacia Biotech公司；

3.3实验过程

将上述含有重组质粒pET-32a-JXA1-ΔNsp7，pET-32a-LV-ΔNsp7的BL21(DE3)菌株在含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上划线，37℃培养过夜，随机挑取单个菌落，与100ml含有Amp抗生素的LB中37℃摇床中培养至OD₆₀₀为0.6～0.7时加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)至终浓度1mM，继续振摇培养3～6小时，收获细菌。离心后将菌体用0.5M NaCL、20mMTris·HCL(pH＝7.6)的缓冲液洗两次，然后用1ml PBS(pH＝7.4)悬浮细胞，经超声波裂解后，加入2×上样缓冲液(100mmol/L Tris·HCL pH＝6.8、200mmol/L二硫苏糖醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油)，煮沸变性后进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，考马斯亮兰染色，观察结果：在带有pET-32a-JXA1-ΔNsp7和pET-32a-LV-ΔNsp7质粒的细菌经诱导后表达在约43kD和45kD处发现明显的一条蛋白条带，而对照细菌没有相应的条带。

实施例4

重组蛋白(pET-32a-JXA1-ΔNsp7，pET-32a-LV-ΔNsp7)的表达和纯化

4.1实验试剂

4×蛋白上样缓冲液：购自北京希尔诚生物科技公司希尔诚；

Tris碱、咪唑、NaCL等纯化用的均为进口分装或国产分析纯。

4.2实验仪器

微量核酸蛋白测定仪：购自日本岛津公司。

SORVALL RC SCPLUS高速离心机：购自Gene公司；

4.3实验过程

4.3.1原核表达重组蛋白的可溶性检测：将诱导表达后的细菌悬液7000r/min离心15min，弃去培养液，保留沉淀菌体，悬浮菌体沉淀，将悬浮细菌置于冰浴中做超声破碎，条件是超声3s，间歇5s，共超声3.5分钟，波幅35％。待超声菌液清亮时，4℃15000r/min离心15分钟，分别收集上清和沉淀。取样进行SDS-PAGE电泳，确定表达产物是以可溶性形式存在(上清)还是以包涵体形式存在(沉淀)。结果显示，该两种重组蛋白均是可溶性表达。

4.3.2收集的上清，加入终浓度为10mM的咪唑，并将此上清加到已平衡好的柱子中，待上清穿过柱子后，用含10mM咪唑的平衡液冲洗柱子，最后用含150mM咪唑的洗脱液将目的蛋白洗脱下来。

4.3.3收集的样品进行SDS-PAGE，检查回收蛋白是否为目的蛋白及纯度。最后用紫外分光光度计测定样品在260nm和280nm波长的光吸收值，按下式计算样品中的蛋白质含量：蛋白质浓度(mg/ml)＝(1.45×A_280nm-0.74×A_260nm)×稀释倍数。

实施例5

重组蛋白的免疫反应活性分析：Western-blotting试验

5.1实验试剂

PRRSV JXA1感染猪血清和SPF猪阴性血清由中国动物疫病预防控制中心制备并保存；欧洲株标准血清：购自北京天之泰生物科技有限公司。

HRP-兔抗猪IgG二抗：购自Sigma公司；

DAB底物显色试剂盒(包括溶液A：浓缩液(20×)；溶液B：浓缩液DAB溶液(20×)；浓缩过氧化氢(20×))，购自中杉金桥公司。

5.2实验仪器

Mini Trans-Blot电转仪：购自BIORAD公司；

空气浴摇床：哈尔滨东联仪器厂。

5.3实验过程

表达蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用含有5％(w/v)脱脂奶粉的1×PBST(pH＝7.4)在37℃温育1小时封闭NC膜；然后分别加入含5％脱脂奶粉、1％美洲型PRRS标准阳性血清的1×PBST和5％脱脂奶粉、1％欧洲型PRRS标准阳性血清的1×PBST中37℃温育1小时；1×PBST洗涤膜三次后用含1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG 37℃温育1小时；用1×PBST洗涤膜三次后，加入DAB显色液进行反应，观察当形成的蛋白带颜色深度达到要求时用水漂洗，加入1×PBST中保存。结果能见到与SDS-PAGE特异性条带相对应的反应条带，而融合蛋白美洲型Nsp7蛋白与一抗为欧洲株标准血清无反应，融合蛋白欧洲型Nsp7蛋白与一抗为美洲株标准血清无反应。表明融合蛋白能与相应的血清发生反应，而无交叉反应，为建立一种鉴别欧洲型与美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的血清学方法提供了理论依据。见图5～8

实施例6

欧洲型、美洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立

6.1实验试剂和耗材

酶标板，购自美国Costar公司；

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒(法国LSI抗体检测试剂盒：LSIVET SUIS PRRSA/S和LSIVET SUIS PRRS E/S)购自北京天之泰生物科技有限公司。

6.2实验仪器

TECAN光吸收酶标仪(SUNRISE)，购自北京东胜创新生物科技有限公司；

DEM-III型自动酶标洗板机，购自北京拓普分析仪器有限责任公司。

6.3实验过程

酶联免疫吸附试验(ELISA)：(1)包被：将两种重组蛋白用包被液稀释，100ul/孔，4℃过夜；(2)洗涤：洗板机将包被液吸出，PBST洗涤液洗涤3次；(3)封闭：加入封闭液5％的脱脂奶粉，300ul/孔，37℃湿盒内封闭1h，同上洗涤；(4)加样：将待检血清用5％脱脂奶粉适当稀释，每孔加100ul，37℃湿盒内作用1h，同上洗涤；(5)加二抗：用5％脱脂奶粉将HRP-兔抗猪IgG按工作浓度稀释，每孔加100ul，37℃湿盒内作用1h，同上洗涤；(6)加底物：每孔加入新配置的底物溶液，各加100ul/孔，室温避光反应15分钟；(7)加终止液：每孔加入100ul 2M H₂SO₄终止反应；(8)测值：自动酶联检测仪测定各孔的光密度吸收值(OD_450nm)。

6.3.1重组蛋白抗原最适包被浓度及待检血清稀释浓度的确定

用包被液将纯化的重组蛋白抗原JXA1-ΔNsp7分别作4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0.25ug/ml，0.125ug/ml 6个倍比稀释度和重组蛋白抗原LV-ΔNsp7分别作3.2ug/ml，1.6ug/ml，0.8ug/ml，0.4ug/ml，0.2ug/ml，0.1ug/ml 6个倍比稀释度，包被酶标反应板，4℃过夜。用血清稀释液将PRRS阳性血清及阴性血清分别进行1∶20、1∶40、1∶80和1∶160倍比稀释，两种抗原各自组成方阵。将包被好的酶标板用洗板机将包被液吸出，1×PBST洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干，加入5％脱脂奶粉封闭液，300ul/孔，37℃湿盒内封闭1h。封闭后，洗涤同上，分别加入倍比稀释好的PRRSV阳性血清和阴性血清，每个抗原稀释度加1孔阳性血清和1孔阴性血清，100ul/孔，37℃湿盒内作用1h，洗涤后，按照方阵每孔加入稀释好的HRP-兔抗猪IgG(1∶35000)100ul，37℃湿盒内作用1h，洗涤后，加入底物100ul/孔，室温显色10min，加入2mol/L H₂SO₄ 100ul终止液终止反应，在酶标仪上读出阳性血清OD₄₅₀值在1.0左右，且阴性值低，P/N值高的抗原浓度和血清工作浓度，从而确定抗原最适包破浓度和血清的稀释度。

6.3.2重组抗原包被条件的确定

以最适抗原浓度包被酶标板，100ul/孔，分成4组。第1组：37℃包被2h；第2组：37℃包被1h；第3组：37℃包被1h加4℃过夜；第4组：4℃过夜。将包被好的酶标板进行洗涤，37℃湿盒内封闭1h，封闭后每孔加入最适的血清稀释度，37℃湿盒内作用1h。洗涤后加入1∶35000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100ul/孔，37℃湿盒内作用1h，洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液，室温显色10min，2mol/LH₂SO₄ 100ul终止液终止反应，记录酶标仪上的OD₄₅₀值，比较阴阳性血清OD₄₅₀值和P/N值，以确定最佳的包被条件。

6.3.3封闭液及其封闭时间的确定

以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，洗涤后，分成4组。第一组为：5％脱脂奶粉；第二组：5％小牛血清；第三组：1％BSA；第四组：1％明胶封闭，设37℃湿盒内封闭0.5小时，1小时，1.5小时，2小时，每个组合分别作4个平行孔。封闭后洗涤，然后在每孔中加入最适稀释度的PRRSV的阴阳性血清100ul，37℃湿盒内作用1h，洗涤后加入1∶35000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100ul/孔，37℃湿盒内作用1h，洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液，室温显色10min，2mol/LH₂SO₄ 100ul终止液终止反应，记录酶标仪上的OD₄₅₀值，比较阴阳性血清OD₄₅₀值和P/N值，以确定和合适的封闭液和封闭时间。

6.3.4酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定

以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，洗涤后，加入5％脱脂奶粉封闭液，300ul/孔，37℃湿盒内封闭1h。封闭后，洗涤同上，将PRRS阳性、阴性血清按最适稀释度稀释，37℃湿盒内封闭1h。HRP-兔抗猪IgG二抗按1∶20000、1∶30000、1∶35000和1∶40000稀释，每个稀释度作4个平行孔，作用30min、60min、90min和120min，洗涤后，每孔加入新鲜配制的底物溶液100ul，室温显色10min，加入2mol/L H₂SO₄ 100ul终止液终止反应，在酶标仪上读出阳性血清OD₄₅₀值在1.0左右，比较阴阳性血清OD₄₅₀值和P/N值，以确定HRP-兔抗猪IgG二抗的稀释倍数和作用时间。

6.3.5血清最佳作用时间的确定

以最适抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，100ul/孔，分成4组。将包被好的酶标板进行洗涤，37℃湿盒内封闭1h，封闭后每孔加入最适的血清稀释度，37℃湿盒内作用30min、60min、90min和120min。洗涤后加入1∶35000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100ul/孔，37℃湿盒内作用1h，洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液，室温显色10min，2mol/LH₂SO₄ 100ul终止液终止反应，记录酶标仪上的OD₄₅₀值，比较阴阳性血清OD₄₅₀值和P/N值，以确定合适的作用时间。

6.3.6底物反应时间的确定

以最适抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，100ul/孔，分成4组。按照前面设定的ELISA程序依次封闭、加入标准阴阳性血清(各4个重复)，再和酶标二抗作用1小时。之后，每孔加入新鲜配制的底物溶液100ul，在室温条件下作用5min、10min、15min、20min，加入2mol/L H₂SO₄ 100ul终止液终止反应，在酶标仪上读出阳性血清OD₄₅₀值在1.0左右，比较阴阳性血清OD₄₅₀值和P/N值，以确定最佳的底物显色时间。

6.3.7间接ELISA方法阴阳性临界值的确定

收集经试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒抗体阴性的SPF猪血清30份，采用已建立的间接ELISA方法检测，作1∶80倍稀释，100ul/孔，每份血清重复2孔，按照已经确定的ELISA程序进行OD₄₅₀测定，计算其OD₄₅₀的平均值及标准方差(SD)，依据阴阳性临界值＝阴性血清OD平均值X+3SD，从而确定阴阳性临界值。根据统计学原则，OD₄₅₀值＞X+3SD时，可以在99.9％的水平上判定为阳性。

6.3.8特异性实验

(1)阻断试验

用血清稀释液把超声离心得到的PRRSV细胞毒做1∶2稀释，同时用将阴阳性血清分别作1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280，1∶2560倍比稀释，阳性血清做两份稀释，分成3个组，第1组：阳性血清加等量未加抗原的血清稀释液作未阻断对照，第2组：阳性血清加等量病毒抗原的血清稀释液，第3组：阴性血清加等量病毒抗原的血清稀释液，混合均匀后，放在37℃反应1h，用最适浓度重组蛋白和最适包被条件包被酶标板，按照已确立的间接ELISA操作程序，对这些血清进行测定。

(2)间接ELISA方法的特异性交叉试验

用纯化好的重组蛋白在最适包被条件下包被酶标板，洗涤封闭后，分别将猪瘟、猪伪狂犬病、猪日本乙型脑炎、猪细小病毒的阳性血清作1∶80稀释，同时作PRRS阳性和阴性血清对照，100ul/孔，37℃湿盒内作用1h，洗涤后加入1∶35000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100ul/孔，37℃湿盒内作用1h，洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液A、B，室温显色10min，2mol/LH₂SO₄ 100ul终止液终止反应，记录酶标仪上的OD₄₅₀值，进行结果判定。

6.3.9重复性试验

取3块不同批次(第1、2、3天)包被的酶标板，检测已知阳性诊断抗原，每个样品设4个重复，在同一块酶标板上进行批内重复，不同的酶标板之间进行批间重复，计算其变异系数，如果变异系数＜10％则说明其重复性和稳定性很好，具有一定的推广价值。

6.3.10已知阳性样本检测(符合试验)

用自己建立的间接ELISA方法进行ELISA测定64份(包括2份国外购买的欧洲株阳性血清)血清样本，同时用法国LSI抗体检测试剂盒：LSIVET SUIS PRRS A/S和LSIVET SUISPRRS E/S按照试剂盒说明书进行操作检测同批样品，比较两者的检测结果。以法国LSI抗体检测试剂盒测得阴性血清中的阴性检出率即为特异性，阳性血清中的检出率即为相对灵敏度。两种方法检测结果一致的血清样本数占总体样本的比例即为两者的符合率。

以JXA1-ΔNsp7为包被抗原建立的ELISA方法与LSIVET SUIS PRRS A/S检测试剂盒相比，其敏感性和特异性分别是90％和94.2％，符合率为92.2％；而LSIVET SUIS PRRS E/S试剂盒和以LV-ΔNsp7为包被抗原建立的ELISA方法检测得知除已知的2份欧洲株血清阳性外，其它全为阴性与国内目前为止尚未发现欧洲型PRRSV大规模的感染，获得的欧洲型PRRSV阳性血清的量有限相符。

序列表

<110>中国动物疫病预防控制中心

<120>欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法

<130>1

<160>8

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>JXA1-Nsp7-F1

<400>1

GCGGATCCTCGCTGACTGGTGCCCTC

<210>2

<211>49

<212>DNA

<213>JXA1-Nsp7-R1

<400>1

CCATGGTGCCTCGGACCTTATCAACATCAGTCCATTTCGTAAGGAAATC

<210>3

<211>49

<212>DNA

<213>JXA1-Nsp7-F2

<400>1

GATTTCCTTACGAAATGGACTGATGTTGAIAAGGTCCGAGGCACCAIGG

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>JXA1-Nsp7-R2

<400>1

CCCAAGCTTTTCCCACTGAGCTCTTCTATTC

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>LV-Nsp7-F3

<400>1

CGGAATTCTCCCTAACGGCTGCTTTAGCTTG

<210>6

<211>51

<212>DNA

<213>LV-Nsp7-R3

<400>1

GACAAAACTCCTTTCATTTTGTCAATGTTCGTTAAGCTGGACAAAAAATCA

<210>7

<211>51

<212>DNA

<213>LV-Nsp7-F4

<400>1

TGATTTTTTGTCCAGCTTAACGAACATTGACAAAATGAAAGGAGTTTTGTC

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>LV-Nsp7-R4

<400>1

CCCAAGCTTTTTCAAGGCAGTTGTCAGGC