固定化乙醇脱氢酶制备技术及性能研究

摘要

乙醇脱氢酶是-种重要的生物催化剂，可有效的催化伯醇与醛之间的可逆反应，已被广泛应用于食品、化工、医疗等行业。然而游离酶的稳定性差，易失活，不能重复使用等，通过固定化技术来克服乙醇脱氢酶应用局限成为酶工程领域研究的热点。
　　 本论文选用壳聚糖、海藻酸钠、明胶、复合硅胶、明胶-海藻酸钠对乙醇脱氢酶进行固定化，以固定化酶的酶活力、活力回收率、相对活力为指标，得到固定化乙醇脱氢酶的最佳制备工艺。以载体的包埋率、偶联率、半衰期等为指标选择出最适合固定乙醇脱氢酶的材料，并对固定化乙醇脱氢酶的酶学性质进行研究。结果如下所示：
　　 以壳聚糖为载体工艺条件是：壳聚糖的粘度是0.013Pa·s,NaOH浓度0.8mol/L，成形时间1.5h，戊二醛浓度6％，交联时间2h，固定4.5h。壳聚糖载体固定率为67.15％，偶联率为92.56％，固定化酶的半衰期为88.17min，连续使用十次后固定化酶的剩余活力为31.18％。
　　 以海藻酸钠为载体的工艺条件是：戊二醛浓度0.5％，海藻酸钠浓度3％，海藻酸钠与酶液的比例1：1，固定化时间1h,CaCl2浓度3％，交联-硬化时间1h。海藻酸钠载体的固定率为76.64％，偶联率为60％，固定化酶的半衰期2.73min。
　　 以明胶为载体工艺条件是：明胶浓度15％，戊二醛浓度4％，交联时间2h,1g明胶颗粒加酶量1ml，固定化时间2.5h。明胶对乙醇脱氡酶的固定率为50.33％,偶联率为52.47％，固定化酶的半衰期26.35min，载体使用十次后仍能保持较大的活性，剩余活力为52.89％。
　　 用壳聚糖和硅胶固定乙醇脱氢酶工艺条件是：3g壳聚糖溶于50m11％的甲酸溶液中，硅胶3g，涂敷4h，戊二醛浓度1％，交联1h,1g载体与1ml酶液混合，固定2h。复合硅胶对乙醇脱氢酶的固定率为47.53％，偶联率为32.96，固定化酶的半衰期为18.24min，连续使用十次后固定化酶的剩余活力为28.31％。
　　 用明胶、海藻酸钠固定乙醇脱氢酶工艺条件是：明胶浓度2％，海藻酸钠浓度6％，等量混匀，放置30min，戊二醛浓度0.5％,CaCl2浓度5％，交联1h。明胶-海藻酸钠的固定率为41.94％，偶联率为61.54％，固定化酶的半衰期为3.03min，连续使用十次后固定化酶的剩余活力为20.08％。
　　 综合各个因素得到，最适的固定乙醇脱氢酶的材料为壳聚糖。对壳聚糖固定化乙醇脱氢酶的酶学性质研究，结果显示：固定化酶的Km值略大约游离酶的Km，固定化酶的最适反应温度有所提高，最适pH也向酸性环境偏移，耐高温、耐酸性有所提高。金属离子Na+、Ca2+、Mg2+、2n2+促进了酶促反应的进行，K+、Cu2+对固定化酶酶活力影响不大，Fe3+却抑制了酶促反应的进行。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 乙醇脱氢酶概述

1.1.1 ADH的来源与种类

1.1.2 乙醇脱氢酶的结构与性能

1.1.3 乙醇脱氢酶的功能与应用

1.2 酶固定化技术简介

1.2.1 酶的固定化方法与原理

1.2.2 固定化载体材料的研究进展

1.2.3 评价酶固定化效果的指标

1.2.4 酶固定化技术的应用研究进展

1.3 课题研究的目的和意义

1.4 主要研究内容

2 壳聚糖固定乙醇脱氢酶工艺研究

2.1 材料与设备

2.1.1 药品与试剂

2.1.2 仪器与设备

2.2 试验方法

2.2.1 乙醇脱氧酶的提取及测定

2.2.2 固定化乙醇脱氢酶的酶活力测定

2.2.3 壳聚糖固定乙醇脱氢酶的制备方法

2.2.4 壳聚糖固定乙醇脱氧酶条件的研究

2.2.5 乙醇脱氧酶固定化效果评价指标

2.3 结果与讨论

2.3.1 壳聚糖固定乙醇脱氢酶条件的确定

2.3.2 壳聚糖固定化乙醇脱氢酶效果的评价

2.4 小结

3 诲藻酸钠固定化乙醇脱氧酶工艺研究

3.1 材料与设备

3.1.1 药品与试剂

3.1.2 仪器与设备

3.2 试验方法

3.2.1 海藻酸钙固定乙醇脱氢酶的制备

3.2.2 海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶艺条件的确定

3.3 结果与讨论

3.3.1 海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶最佳固定化条件

3.3.2 海藻酸钙固定化乙醇脱氢酶性能评价

3.4 小结

4 明胶固定化乙醇脱氢酶工艺研究

4.1 材料与设备

4.1.1 药品与试剂

4.1.2 仪器与设备

4.2 试验方法

4.2.1 明胶固定乙醇脱氢酶的制备

4.2.2 明胶固定化乙醇脱氢酶条件的确定

4.3 结果与讨论

4.3.1 明胶固定化乙醇脱氢酶条件选择

4.3.2 明胶固定化乙醇脱氢酶效果评价指标

4.4 小结

5 复合硅胶固定化乙醇脱氢酶制备工艺研究

5.1 材料与设备

5.1.1 药品与试剂

5.1.2 仪器与设备

5.2 试验方法

5.2.1 复合硅胶固定乙醇脱氢酶的制备

5.2.2 复合硅胶固定化乙醇脱氢酶条件的确定

5.3 结果与讨论

5.3.1 复合硅胶固定化乙醇脱氢酶最佳固定化条件

5.3.2 复合硅胶固定化乙醇脱氢酶效果评价

5.4 小结

6 明胶-海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶制备工艺研究

6.1 材料与设备

6.1.1 药品与试剂

6.1.2 仪器与设备

6.2 试验方法

6.2.1 明胶-海藻酸钠固定乙醇脱氧酶的制备

6.2.2 明胶-海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶条件的确定

6.3 结果与讨论

6.3.1 明胶-海藻酸钠固定化乙醇脱氧酶条件确定

6.3.2 明胶-海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶的固定化效果评价

6.4 小结

7 最适材料的选择

7.1 固定化乙醇脱氢酶活力的比较

7.2 载体固定率的比较

7.3 偶联率的比较

7.4 半衰期的比较

7.5 使用寿命比较

7.6 结论

7.7 小结

8 壳聚糖载体固定化乙醇脱氢酶酶学性质研究

8.1 材料与设备

8.1.1 药品与试剂

8.1.2 仪器与设备

8.2 试验方法

8.2.1 壳聚糖固定化乙醇脱氢酶酶学性质研究

8.3 结果与讨论．

8.3.1 壳聚糖固定化乙醇脱氢酶酶学性质研究

8.4 小结

9 结论与展望

9.1 课题结论

9.2 课题展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文