牛羊大肠杆菌K99-STⅠ双价保护性抗原基因工程菌株的构建及免疫原性研究

摘要

论述了包涵体粗提物蜂腔疫苗、工程菌全菌体蜂胶苗、工程菌全菌体灭活苗的构建及免疫原性实验，全文主要内容如下： 1．采用PCR技术，扩增出0.54kb的K99(F5)菌毛抗原基因，将其克隆到pUCm-T载体上，酶切鉴定成功构建重组质粒pUCm-K99；人工合成的、耐热肠毒素ST I基因片段和重组质粒,PUCm--K99，经酶切(BamH I+Sal I)、回收、连接，将ST I基因片段插入K99菌毛抗原基因的下游，经酶切和PCR方法鉴定，获得阳性重组质粒pUCm-K99-ST，经过测序分初证明完成K99-ST融合基因的构建。 2．重组质粒pUCm-K99-ST经EcoR I+Sa/I消化，获得K99-ST基因片段。将该片段分别插人表达载体．pGEX-4T-1及pET-30a中，筛选阳性重组质粒分别命名为pGEX-K99-ST和pET-K99-ST。将重组质粒pGEX-K99-ST和pET-K99-ST分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，摸索最洼诱导条件(37℃，IPTG0.4mM/l，220r/min诱导4h)，SDS电泳分析，pGEX-K99-ST表达童相对较低，约为10％左右；而pET-K99-ST表达量较高约为25％以上；融合蛋白经回收、复性处理后，琼扩实验结果表明，K99-ST融合基因在工程菌BL21中获得表达，并具有与K99抗体结合的活性。 3．通过反向间接血凝技术，检测融合蛋白复性后的抗原滴度可以达到1：40。纯化融合蛋白后，使用弗氏佐剂对其进行包裹并免疫家兔(1d，14d，21d)，免疫剂量(抗原滴度是1：40为0.5mL/只，Western-blot证实融畲蛋白具有良好的免疫原性。根据专利ZL8910687 6配制相应疫苗(包涵体粗提物蜂腔疫苗、工程菌全菌体蜂胶苗、工程菌全菌体灭活苗)，使用小白鼠进行安全性试验和动物攻击试验，试验证实安全性良好，保护率较高。上述三种疫苗免疫家兔后采集抗血清，与处理后的强毒株上清温育时1-3日龄的乳鼠进行毒素中和试验，试验证实抗血清足以中和强毒株的STI肠毒素。

目录

论文说明：英文缩写词表

声明

摘要

前言

第一部分文献综述

1综述前言

2毒力因子

2.1黏附素

2.2肠毒素

3毒力岛

4产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进展

4.1大肠埃希氏茵K88-K99双价基因工程疫苗

4.2大肠埃希氏菌K88ac-LTB双价基因工程疫苗

4.3大肠埃希氏菌K99-F41双价基因工程疫苗

4.4大肠埃希氏菌ST-LT双价基因工程疫苗

第二部分大肠杆菌菌毛抗原K99与耐热肠毒素STI融合基因的克隆与核苷酸序列测定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1目的基因K99序列的扩增

2.2 K99目的基因与pUCm-T载体连接

2.3融合基因的构建

2.4K99目的基因及K99-ST融合基因测序

3小结与讨论

3.1小结

3.2引物的设计

3.3选择合适的内切酶用来鉴定

3.4融合基因的构建

第三部分融合基因K99-ST原核表达系统的构建和融合蛋白的表达

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 pGEX-K99-ST和pET-K99-ST原核表达载体的构建

2.2表达产物的SDS-PAGB分析

2.3表达产物的琼扩试验

3讨论

3.1重组子的鉴定

3.2融合蛋白的表达

3.3表达产物的蛋白电泳(SDS-PAGE)

3.4包涵体的纯化、复性

第四部分重组蛋白免疫原性的检测

1材料与方法

1.1试验动物和器材

1.2 RIHA方法检测融合蛋白抗原滴度

1.3表达产物的Western-blot分析

1.4重组菌株STI毒性的测定

1.5抗原制备

1.6安全性试验及动物保护性试验

1.7毒素中和试验

2结果

2.1 RIHA方法检测融合蛋白表达量

2.2表达产物的Western-blot分析

2.3重组菌株毒性的测定

2.4安全性及免疫保护试验

2.5 STI肠毒素中和试验

3.讨论

3.1反向间接血凝

3.2表达产物的免疫印迹(Western-blot)

3.3免疫攻毒保护试验

第五部分结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文