利用RP-HPLC分离小麦醇溶蛋白和高分子量谷蛋白亚基的研究

摘要

麦醇溶蛋白和高分子量麦谷蛋白亚基作为小麦贮藏蛋白的重要组成部分，其组成和含量对小麦面粉的烘烤品质有重要影响。近年来随着小麦胚乳贮藏蛋白研究的不断深入，麦醇溶蛋白和高分子量麦谷蛋白亚基的分离纯化成为热门研究领域。现代分子生物技术的发展以及一些先进的分离手段的出现，大大促进了小麦贮藏蛋白的研究。其中反相高效液相色谱技术的发展为我们提供了快速分离和定量分析小麦贮藏蛋白的有效方法。 本研究旨在建立小麦醇溶蛋白和高分子量麦谷蛋白亚基有效分离鉴定的反相高效液相色谱法，同时分析长期定位施肥下冬小麦烟优361的麦醇溶蛋白和高分子量麦谷蛋白亚基的变化，为通过改变施肥水平提高小麦品质，提供理论依据。 主要研究结果如下： 1．本研究系统分析了洗脱时间、色谱柱温度、流速、洗脱梯度、蛋白提取方法等对利用反相高效液相色谱法分离小麦醇溶蛋白的影响，利用反相高效液相色谱柱(ZORBAX300SB-C18 Stable Band Analytical 4.6×150mm，5-Micron)和Aglient 1100高效液相色谱系统，建立了适合我国小麦醇溶蛋白分析的反相高效液相色谱技术体系。该体系的主要参数包括：利用0.05M NaCl→H<,2>O→70％乙醇的三步提取法、柱温60℃、流速1.0ml/min、进样量15ul、洗脱梯度55 min内流动相B的体积比由21％升到48％(v/v)。本研究结果表明，RP-HPLC可作为利用小麦醇溶蛋白鉴定不同小麦品种的可靠方法。 2．本研究系统分析了洗脱时间、色谱柱温度、流速、洗脱梯度等对利用反相高效液相色谱法分离小麦高分子量谷蛋白亚基的影响，利用反相高效液相色谱柱(ZORBAX300SB-C18 Stable Band Analytical 4.6x150mm，5-Micron)和Aglient 1100高效液相色谱系统，建立了适合我国小麦HMW-GS的反相高效液相色谱技术体系。该体系的主要参数包括：柱温60℃、流速1.0ml/min、进样量15ul、洗脱梯度30 min内流动相B的体积比由21％升到36％(v/v)。本研究结果表明，RP-HPLC可作为小麦品质改良中优质亚基鉴定筛选的有力工具。 3．本研究利用反相高效液相色谱技术分析了26年长期定位施肥条件下的烟优361麦醇溶蛋白的变化，结果表明：麦醇溶蛋白的亚基组成数量不受施肥水平的影响，但是亚基含量有所差异。ω-醇溶蛋白受肥力水平的影响较小，除N<,2>PK条件使其含量降低外，其他10个处理与对照相比变化很小。丫-醇溶蛋白、α/β-醇溶蛋白受环境影响较大，在N<,1>、M<,1>N<,1>、M<,1>N<,2>、M<,2>N<,1>、M<,2>N<,2>、N<,2>P、N<,2>K八种处理时蛋白含量与对照相比显著增加，M<,2>、N<,2>PK施肥水平与对照相比能减少其含量。N<,1>施肥水平γ-醇溶蛋白增幅最大，N<,2>P处理时α/β-醇溶蛋白与对照相比增幅高达215.8％。 4．本研究利用反相高效液相色谱技术分析了26年长期定位施肥条件下的烟优361高分子量麦谷蛋白亚基的变化结果表明：1Dx5、1Dy10、1Bx17、1By18、1Ax1在12个不同处理问的变化趋势基本一致，受不同肥力处理的影响较大。在N<,1>、N<,2>、M<,2>N<,2>、N<,2>P、N<,2>K五种肥力条件，优质蛋白亚基1Dx5、1Dy10、1Bx17、1By18与对照相比均有较大提高，当土壤中氮素含量为138kg.hm-2时含量最高。

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综述

1.小麦贮藏蛋白的组成

2.小麦高分子量谷蛋白

2.1 HMW-GS的基因定位及变异

2.2 HMW-GS与小麦品质的关系

3.小麦酵溶蛋白

3.1麦醇溶蛋白的分子特征

3.2麦醇溶蛋白与小麦品质的关系

4.小麦贮藏蛋白的分离分析方法

4.1十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

4.2酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳

4.3双向电泳(A-PAGE×SDS-PAGE、IEF×SDS-PAGE)

4.4高效毛细管电泳

4.5高效液相色谱

4.6质谱(Mass Spectrometry，MS)技术

5.反相高效液相色谱在小麦贮藏蛋白分离纯化中的应用

6.不同施肥水平对小麦产量及其品质的影响

7.本研究的基本思路和目标

7.1小麦醇溶蛋白和高分子量谷蛋白亚基RP-HPLC分离法的建立

7.2不同施肥条件下小麦贮藏蛋白亚基组成的变化

材料与方法

1.实验材料

2.仪器设备

3.试验试剂

4.实验程序

4.1溶液配制

4.2高效反相液相色谱试验方法

4.3长期定位施肥试验设计

4.4长期定位施肥试验方法

研究内容与结果分析

1.小麦醇溶蛋白RP-HPLC方法的建立

1.1小麦籽粒醇溶蛋白质提取方法的确定

1.2洗脱梯度的确定

1.3色谱柱温度对分离结果的影响

1.4洗脱时间对分离效果的影响

1.5流速对分离效果的影响

1.6试验方法的稳定性

1.7不同倍性小麦品种及小麦近缘种的RP-HPLC分离

2.小麦HMW-GS的RP-HPLC方法的建立

2.1小麦籽粒HMW-GS的提取方法

2.2色谱柱温度对分离效果的影响

2.3洗脱梯度及时间的确定

2.4流速对分离效果的影响

2.5不同小麦品种及小麦近缘种的SDS-PAGE分离分析

3.不同施肥种类和数量条件下小麦烟优361醇溶蛋白和HMW-GS的RP-HPLC分析

3.1不同施肥种类和数量条件下小麦烟优361醇溶蛋白RP-HPLC分析

3.2不同施肥种类和数量条件下小麦烟优361HMW-GS的RP-HPLC分析

讨论

1.小麦醇溶蛋白RP-HPLC分离分析

2.小麦HMW-GS的RP-HPLC分离分析

3.RP-HPLC与电泳方法的比较分析

4.不同施肥种类和数量条件下冬小麦烟优361的RP-HPLC分析

结论

参考文献

致谢