基于Fe3O4/Au纳米粒子的金磁免疫探针的构筑及其在即时检测的应用研究

摘要

近年来，以胶体金、荧光量子点、上转换化学发光材料为载体的即时检测(Point-of-care Testing，POCT)成为医学诊断领域的研究热点。核壳结构Fe3O4/Au纳米粒子或花状结构Fe3O4/Au/Fe3O4纳米粒子（以下统称为金磁微粒）作为潜在的生物标记材料备受关注。这种新型无机/无机复合材料具有高比表面积、便捷的生物或药物分子修饰以及良好的超顺磁性，已经被用在磁酶免化学发光检测、磁导靶向给药等领域。但将水相合成的金磁微粒(GoldMag)用于POCT检测，包括侧向流免疫层析和光学比色检测，尚需克服材料本身的一些缺陷，如在缓冲液中的聚集、纳米Fe3O4种子对金磁微粒组装的局域表面等离子共振(LSPR)及分散度的影响。另外，复杂的表面对探针组成-检测性能的关系、纳米粒子-生物界面的相互作用产生干扰，限制了金磁微粒在目视化或快速层析检测中的应用。为此，研究兼具光学和磁学特性、具有良好分散和稳定性能的免疫探针，并将其应用于临床即时检测，包括基于光学的目视化检测和基于磁学的定量检测，是纳米金磁微粒深入研究的一项挑战，也对临床快速检测新方法的建立具有积极意义。本研究结合纳米粒子表面改性技术及表面功能化技术，选择多种抗原和抗体标记，在经过修饰的金磁微粒表面进行固定化，构筑了基于Fe3O4/Au纳米粒子的金磁免疫探针，并将其用于纳米粒子比色光学检测方法的建立和免疫层析定性及定量系统的构建。本论文主要包括以下三方面内容: (1) Fe3O4/Au纳米粒子的制备及稳定机理的建立。考察了不同表面活性剂对金磁微粒预分散效果的影响，研究了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与Fe3O4/Au纳米粒子的相互作用及稳定机理。以巯基化十一烷酸(MUA)部分配体取代CTAB得到MUA-Fe3O4/Au纳米粒子。采用聚丙烯酸钠(PAA)及聚甲基丙烯酸钠(PMAA)在CTAB-Fe3O4/Au纳米粒子表面组装，制备PAA-Fe3O4/Au纳米粒子及PMAA-Fe3O4/Au纳米粒子。CTAB与MUA的协同作用使MUA-Fe3O4/Au纳米粒子在较宽pH范围内具有良好的分散稳定性。PAA-Fe3O4/Au纳米粒子及PMAA-Fe3O4/Au纳米粒子在高离子浓度的溶液中表现出更好的耐离子屏蔽作用，聚合物长链不但为纳米粒子提供了离子稳定性，还提供了空间位阻效应。配体取代和聚合物改性得到的羧基化表面纳米粒子，为后续抗体偶联提供了活性基团。 (2)基于Fe3O4/Au纳米粒子的金磁免疫探针的构建及在比色检测中的应用研究。研究对比了两种表面修饰方法得到纳米粒子的稳定性:在生理缓冲液中都具有良好的分散稳定性，而在高离子浓度溶液中(I=100 mmol/L)，PAA-Fe3O4/Au纳米粒子比MUA-Fe3O4/Au纳米粒子的稳定性更强。以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)为连接子，将羊抗兔IgG抗体偶联于改性的纳米粒子表面，并用于液相体系中兔IgG的光学比色检测。结果表明:基于PAA-Fe3O4/Au和MUA-Fe3O4/Au纳米粒子的金磁免疫探针都可以实现比色检测，而进一步的动力学研究表明金磁免疫探针与靶抗体的反应符合二级反应特征。基于MUA-Fe3O4/Au纳米粒子构建得到的免疫探针比基于PAA-Fe3O4/Au纳米粒子构建的对待检测物的反应更灵敏，其即时检测灵敏度为50 nmol/L，反应速率常数是后者的二倍。 (3)基于Fe3O4/Au纳米粒子的免疫层析系统用于定性及定量即时检测的研究。通过不同表面特性纳米粒子的筛选，PMAA-Fe3O4/Au纳米粒子适用于构建氨基末端脑尿肽(NT-proBNP)检测用免疫层析系统，而PAA-Fe3O4/Au纳米粒子则适用于梅毒螺旋体抗体（anti-Tp）检测用免疫层析系统。分别将NT-proBNP抗体及重组梅毒螺旋体抗原（r-Tp）偶联于Fe3O4/Au纳米粒子表面，通过双抗夹心原理分别实现目标待检物的高度特异性即时检测。以检测灵敏度为目标函数，调整体系参数，结果表明基于PMAA-Fe3O4/Au纳米粒子的免疫层析试纸条，检测限可达到很高的灵敏度（100 pg/mL），而针对anti-Tp抗体的检测Cut-off值可达到1 NCU/mL。将基于PMAA-Fe3O4/Au纳米粒子的免疫层析试纸条应用于磁免疫色谱分析系统(MAR)进行磁信号采集，磁信号强度与待检测浓度呈线性关系(R2=0.998)，可实现定量检测的目标。将基于PAA-Fe3O4/Au纳米粒子的免疫层析试纸条应用于1020例临床实验，结果表明，与商业化试纸条作比较，其检测的血清阳性符合率及阴性符合率可达97.7％和97.1％。第三方试剂实验验证结果表明，基于PAA-Fe3O4/Au纳米粒子的免疫层析试纸条具有更高的准确性和检测灵敏度，可用于梅毒患者的初筛。

目录

摘要

符号说明

1 绪论

1．1 生物医用无机纳米粒子的研究进展

1．1．1 无机纳米粒子的制备

1．1．2 无机纳米粒子的稳定机制

1．1．3 无机纳米粒子的表面修饰

1．2 纳米粒子用于免疫检测的研究进展

1．2．1 比色光学检测研究进展

1．2．2 免疫层析技术研究进展

1．2．3 抗体与纳米粒子表面的抗体标记

1．3 金磁纳米复合微粒研究进展

1．3．1 金磁纳米复合微粒的制备

1．3．2 金磁纳米复合微粒的表征

1．3．3 金磁纳米复合微粒表面在生物医药领域中的应用

1．4 课题的提出

2．核壳Fe3O4／Au纳米粒子的制备及表面修饰

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验材料及试剂

2．2．2 主要仪器设备

2．2．3 溶液的配制

2．2．4 金磁微粒的制备及表面性质研究

2．2．5 金磁微粒的酸处理及预分散

2．2．6 基于配体交换的表面修饰

2．2．7 基于阴离子聚合物的表面修饰方法

2．2．8 金磁微粒的测试与表征

2．3 结果与讨论

2．3．1 金磁微粒制备及表面性质

2．3．2 GoldMag的表面性质

2．3．3 酸处理对金磁微粒的影响

2．3．4 表面活性剂的筛选

2．3．5 配体小分子与Fe3O4／Au纳米粒子表面的作用方式

2．3．6 聚合物对Fe3O4／Au纳米粒子表面的修饰作用

2．4 本章小结

3．基于Fe3O4／Au纳米粒子的金磁免疫探针用于光学比色检测研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验设备

3．2．3 溶液的配制

3．2．4 稳定性的比较

3．2．5 Fe3O4／Au纳米粒子元素分析

3．2．6 偶联率计算方法的建立

3．2．7 RIgG-Fe3O／Au免疫探针的制备

3．2．8 液相中的比色检测

3．2．9 比色检测过程的动力学分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 核壳Fe3O4／Au纳米粒子的稳定性研究

3．3．2 Fe3O4／Au纳米粒子浓度的计算

3．3．3 Lowry法蛋白定量的标准曲线

3．3．4 EDC对Lowry法蛋白定量的干扰及消除

3．3．5 pH及抗体投入量对金磁免疫探针的影响

3．3．6 比色光学检测限、检测灵敏度的确定

3．3．7 比色检测的动力学研究

3．4 本章小结

4 氨基末端脑尿肽前体检测用金磁免疫探针的构筑及免疫定量检测

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料及试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 溶液的配制

4．2．4 免疫层析试纸条的装配及氨基末端脑尿肽的检测方法

4．2．5 金磁免疫探针构建的优化及核壳Fe3O4／Au纳米粒子的筛选

4．2．6 免疫层析条件的优化

4．2．7 检测灵敏度、检测特异性的确定

4．2．8 磁定量检测方法

4．3 实验结果及讨论

4．3．1 金磁免疫探针构建的优化及纳米粒子的筛选

4．3．2 层析条件对系统检测的影响

4．3．3 检测灵敏度、检测特异性的确定

4．3．4 磁定量对免疫层析检测的影响

4．4 本章小结

5 梅毒即时检测用金磁免疫探针的构筑及临床实验

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验材料及仪器

5．2．2 免疫层析检测anti-Tp抗体用试纸条的装配及检测方法

5．2．3 溶液的配制

5．2．4 r-Tp抗原标记Fe3O4／Au纳米粒子及优化

5．2．5 检测灵敏度、检测特异性的确定

5．2．6 临床实验

5．3 结果与讨论

5．3．1 纳米粒子的选择及标记条件对检测的影响

5．3．2 检测灵敏度、检测特异性的确定

5．3．3 临床实验结果及统计学方法分析

5．4 本章小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 论文工作展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的论文和专利

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