双抗夹心ELISA法检测乳房炎小鼠模型SIgA的研究

摘要

为了深入研究奶牛乳房炎的局部粘膜免疫情况，揭示其发生机理，需要建立一种快速而准确地测定乳汁中SIgA含量的方法。本研究分别从奶牛初乳SIgA的提纯方法、小鼠乳房炎模型的建立和双抗夹心ELISA法测定乳中SIgA，并针对这三个方面进行了方法学研究;同时对小鼠乳中SIgA的含量进行了检测。研究发现:
　　 1、通过反复离心和透析等步骤对奶牛乳汁进行粗提，样品浓缩后上DEAESepharose(FastFlow)柱，用0.02mol/L(PH=8.0)至0.3mol/L(PH=8.0)PBS梯度洗脱;收集峰蛋白，并上葡聚糖凝胶-200层析柱，用0.01mol/L(PH=7.4)PBS洗脱;收集出现蛋白峰的洗脱液，经SDS-PAGE电泳鉴定，为SIgA单体。经初步测定奶牛初乳中SgA含量为3.47mg/ml。
　　 2、用灭菌生理盐水配制浓度分别为105CFU/mL和1012CFU/mL的大肠杆菌O78悬液。取受孕雌鼠18只，随机分为三组:对照组、低浓度组和高浓度组。对小鼠第四对乳房分别注射0.5mL生理盐水（灭菌）和105CFU/mL的大肠杆菌混悬液以及生理盐水（灭菌）和1012CFU/mL的大肠杆菌浓混悬液。注射后观察各组小鼠48h内的临床症状，然后剖杀小鼠，取第4对乳腺制备切片，结果发现48h内高浓度组小鼠完全出现乳房炎临床症状，低浓度组症状较轻，对照组未出现任何症状。乳房炎小鼠乳腺组织切片显示，乳腺组织泡腔内有大量炎性细胞浸润，以嗜中性粒细胞（PMN）为主，小叶间导管均有不同数量的红细胞浸润。结果表明本研究成功地建立了小鼠乳房炎模型。
　　 3、通过制备抗血清、特异性检验、兔抗牛酶标抗体的制备及其效价的检测，本研究确立了小鼠乳汁SIgA检测的双抗夹心ELISA方法。其具体条件为:抗体的最佳包被浓度为10μg/mL，酶标抗体最适工作浓度为1∶800.4℃过夜包被，37℃封闭2h，待检样品反应时间为45min，酶标抗体作用时间为60min，底物作用时间为15min。绘制了双抗夹心ELISA的剂量反应曲线，得出回归方程为:y=0.2271x-0.3639，R2=0.962，其中x=1g（SIgA浓度），最低检测限为4ng/mL。
　　 4、采用双抗夹心ELISA方法，检测了乳房炎模型小鼠乳汁和乳腺组织中SIgA含量的变化。结果表明，乳房炎小鼠乳汁和乳腺组织中SIgA浓度都显著高于正常小鼠;随着产后时间的推移，乳汁中SIgA浓度呈现动态变化:初乳时最高，之后锐减，然后在小范围内波动。

目录

摘要

英文缩写词与名词解释

前言

文献综述

1 奶牛乳房炎研究进展

2 黏膜免疫及SIgA的研究进展

3 ELISA技术研究进展

试验一 奶牛初乳SIgA的提纯与电泳分析

1 材料

1．1 奶牛初乳

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 溶液配制

2 方法

2．1 奶牛初乳中sIgA的粗提

2．2 透析袋的准备

2．3 装柱、加样

2．4 奶牛初乳中SIgA的纯化

2．5 溶液中SIgA浓度的测定方法

2．6 SIgA的SDS-PAGE电泳试验

3 结果

3．1 奶牛初乳SIgA的层析纯化

3．2 奶牛初乳SIgA的电泳分析结果

4 讨论

4．1 奶牛初乳SIgA粗提方法的选择

4．2 奶牛初乳中SIgA含量

4．3 奶牛初乳中SIgA的层析洗脱曲线

4．4 奶牛初乳中SIgA的SDS-PAGE电泳分析

5 小结

试验二 小鼠乳房炎模型韵建立

1 材料

1．1 实验动物

1．2 菌种

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 溶液配制

2 方法

2．1 细菌培养及计数

2．2 试验分组

2．3 人工感染方法

2．4 病料采取及处理

2．5 病理切片的制备

2．6 乳腺炎发病的临床判断标准

3 结果

3．1 注射大肠杆菌后48h内观察小鼠乳房局部及乳房炎临床变化

3．2 乳房炎小鼠组织切片结果

4 讨论

4．1 小鼠乳房炎模型的建立

4．2 切片结果分析

5 小结

试验三 检测小鼠乳汁SIgA的双抗夹心ELI SA方法的建立

1 材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 溶液配制

2 方法

2．1 乳化的方法

2．2 兔抗牛SIgA的制备

2．3 抗血清的特异性鉴定

2．4 兔抗牛酶标抗体的制备(改良过碘酸钠法)

2．5 建立双抗体夹心ELISA试验检测小鼠SIgA的各反应条件的确定

2．6 标准曲线的绘制及回归方程的建立

3 结果

3．1 兔抗牛SIgA抗体的特异性鉴定结果

3．2 兔抗牛SIgA酶标抗体效价的测定

3．3 最佳抗体包被浓度和酶标抗体工作浓度确定

3．4 抗体包被条件的确定

3．5 封闭时间的确定

3．6 最适待检样品反应时间的确定

3．7 最适酶标抗体作用时闻的确定

3．8 最适底物作用时间的确定

3．9 标准曲线

4 讨论

4．1 小鼠乳中SIgA的检测意义

4．2 双抗夹心ELISA中标准曲线的绘制

5 小结

试验四 小鼠SIgA的检测及变化情况的研究

1 材料

1．1 待检乳汁

1．2 待检乳腺组织

1．3 主要仪器

2 方法

3 结果

3．1 小鼠乳汁SIgA浓度的ELISA测定结果

3．2 小鼠乳腺组织SIgA浓度的ELISA测定结果

4 讨论

4．1 小鼠模型泌乳期的划分

4．2 小鼠乳汁中SIgA浓度检测结果分析

4．3 小鼠乳腺组织中SIgA浓度检测结果分析

5 小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文

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