肿瘤基因工程纳米乳剂疫苗的药效学研究

摘要

恶性肿瘤严重威胁人类生命和健康。恶性肿瘤的三大传统疗法-手术、放疗和化疗，治疗效果并不理想。随着免疫学、细胞生物学及分子生物学的飞速发展，肿瘤疫苗的研制与应用已成为治疗肿瘤复发、转移的有力手段。但由于存在缺乏特异性肿瘤抗原和有效的抗原提呈，以及MHC限制性、肿瘤异质性、疫苗生物利用度差等问题，使得现有疫苗的免疫效果不尽人意。黑色素瘤抗原(MelanomaAntigen，MAGE)是首先被发现的人类肿瘤特异性抗原，MAGE-1是MAGE家族的重要成员之一，广泛表达于多种组织的肿瘤，而在除睾丸和胎盘外的正常组织中均不表达，是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子。目前，基于MAGE-1的肿瘤疫苗能诱导MAGE-1特异性CTL的产生，在肿瘤免疫治疗方面倍受重视。热休克蛋白(HeatShockProtein，HSP)具有分子伴侣作用，参与肿瘤抗原的加工递呈，在诱导肿瘤免疫反应中发挥重要作用；最近研究表明，制备结核杆菌HSP70与目的抗原融合蛋白是提高疫苗效能的有效方法。超抗原SEA可有效激活CD4+T细胞，协同加强肿瘤抗原的免疫效果。纳米载药系统是近年来蓬勃发展起来的全新的药物载体，可有效提高所载药物，特别是蛋白质药物的生物利用度，与传统载药系统相比有很多优点。 本研究首先以肿瘤特异性抗原MAGE-1与热休克蛋白HSP70的融合蛋白为基础，与超抗原葡萄球菌肠毒素A(SEA)按摩尔比100∶1制成复合抗原(MHS)；再以纳米乳剂为药物载体包裹MHS，制备出油包水型(W/O)纳米乳剂疫苗NE(MHS)，着重对其进行药效学实验研究，为新型广谱肿瘤基因工程纳米疫苗临床前研究奠定基础。 1.纳米乳剂疫苗的剂量与抗肿瘤效应间的量效关系目的：观察NE(MHS)与荷B16-MAGE-1肿瘤C57BL/6小鼠肿瘤抑制率之间的剂量-效应关系，确定肿瘤抑制率分别为30％和50％的有效剂量和半数有效量(ED50)，并明确高剂量给药后小鼠的毒性反应。方法：磁力超声法制备包裹复合抗原疫苗(融合蛋白MAGE-1/HSP70与超抗原SEA按摩尔比100∶1混合)的油包水型纳米乳剂NE(MHS)，并评价其粒径、包裹率及稳定性；将NE(MHS)腹腔注入荷B16-MAGE-1肿瘤C57BL/6小鼠体内，设低、中、高3个剂量组，以明确NE(MHS)剂量与肿瘤抑制率间的关系，求得抑瘤率分别为30％和50％的有效剂量和半数有效量(ED50)；观察高剂量治疗组小鼠的一般毒性反应，检查血常规、肝、肾功，并剖检动物，计算脏器指数，重要脏器行病理学观察。结果：①成功制备出粒径为20±5nm的纳米乳剂，其药物包裹率为87％，于4℃放置6个月后或3000rpm10分钟离心后无分层，证明其稳定性良好；②中、高剂量组的平均抑瘤率均大于30％，且和阴性对照组有显著性差异，三组剂量的对数值和肿瘤抑制率呈线性关系且具有剂量依赖性：③与PBS对照组相比，高剂量治疗组小鼠未见明显毒性反应。结论：该肿瘤基因工程纳米乳剂疫苗具有良好的理化性质，能有效地抑制肿瘤生长，并使用安全，是一种很有希望的新型抗肿瘤疫苗。 2.纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究目的：评价NE(MHS)的抗肿瘤免疫学特性。方法：以疫苗免疫动物，IFN-γELISPOT和LDH杀伤实验检测疫苗激活机体特异性细胞免疫反应，ELISA法检测体液免疫反应；肿瘤治疗、攻击实验以及预防肿瘤转移和切除后复发实验检测纳米乳剂疫苗的抗肿瘤效应；流式细胞仪检测脾脏中CD4+、CD8+T细胞情况；RT-PCR检测肿瘤局部组织IL-2，IFN-γ和TNF-α的表达。结果：与其它组相比，NE(MHS)组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量明显增多(P＜0.05)，CTL对B16-MAGE-1的特异性杀伤作用明显增强，MAGE-1抗体水平较NE(MH)、MH、NE(-)和PBS组明显增高(P＜0.05)；在肿瘤治疗实验中，NE(MHS)组B16-MAGE-1肿瘤体积明显小于其它组，荷瘤小鼠生存期显著大于其它组(P＜0.01)；在肿瘤攻击实验中，NE(MHS)组B16-MAGE-1肿瘤成瘤时间长、成瘤率低；在预防肿瘤转移和预防肿瘤切除后复发实验中，与其它组小鼠相比，NE(MHS)免疫后小鼠B16-MAGE-1肺脏转移结节数明显减少(P＜0.01)，肿瘤切除后复发时间延迟，复发率明显降低；流式细胞术检测NE(MHS)免疫后小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞增多，并以CD8+T细胞增多为主；NE(MHS)免疫后的小鼠肿瘤局部组织经RT-PCR检测有明确IL-2和TNF-α的表达。结论：NE(MHS)能够刺激机体产生强烈的MAGE-1特异性的细胞免疫和较强的体液免疫反应，对表达MAGE-1的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用，对荷瘤小鼠有很好的治疗作用，能有效预防肿瘤攻击、肿瘤转移和肿瘤切除后复发。 3.纳米乳剂疫苗经不同途径免疫的抗肿瘤免疫学效应研究目的：评价NE(MHS)经不同途径免疫小鼠后的抗肿瘤免疫学特性，探索肿瘤纳米乳剂疫苗全新、有效的给药途径。方法：小鼠经口服(p.o.)、静脉(i.v.)、皮下(s.c.)、腹腔(i.p.)4种途径以NE(MHS)免疫，IFN-γELISPOT和LDH杀伤实验检测疫苗激活机体特异性细胞免疫反应的情况；肿瘤治疗、攻击实验评价疫苗的抗肿瘤效应。结果：治疗实验中，B16-MAGE1接种后第28天，与注射免疫的其他3组相比，口服组小鼠肿瘤体积较大(P＜0.05)；除此，IFN-γELISPOT、LDH杀伤实验和肿瘤攻击实验中各项指标，经4组小鼠组间比较，均无统计学差异。结论：纳米乳剂疫苗NE(MHS)经不同途径给药后免疫效果相近，NE(MHS)适用于多种途径给药，是一种使用方便的肿瘤基因工程纳米疫苗。 综上所述，本研究成功制备出粒径为20±5nm的W/O型纳米乳剂疫苗NE(MHS)，其稳定性良好，药物包裹率较高；NE(MHS)能有效抑制肿瘤生长，与荷B16-MAGE-1小鼠肿瘤抑制率间具有很好的量效关系；NE(MHS)能诱导机体产生强烈的MAGE-1特异性CTL，对表达MAGE-1的肿瘤具有良好的治疗和预防作用；以不同的方式免疫小鼠后，NE(MHS)的短期抗肿瘤免疫学特性相近。本研究为研制高效、生物利用度高、使用安全、方便的肿瘤疫苗开辟了新途径，为本疫苗的临床前研究奠定了良好基础。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

前言

文献回顾

1肿瘤免疫与肿瘤疫苗

2肿瘤抗原

3纳米药物载体

实验材料及仪器

实验一纳米乳剂疫苗剂量与抗肿瘤效应间的量效关系

实验二纳米乳剂疫苗抗肿瘤免疫学效应研究

实验三纳米疫苗不同免疫途径的抗肿瘤免疫学效应研究

小 结

参考文献

个人简历及研究成果

致 谢