盐酸甲氯芬酯对人视网膜色素上皮细胞脂褐素清除作用的实验研究

摘要

目的：年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，AMD)，是发达地区50岁老年人最常见的致盲眼病之一。随着社会的老龄化，发病率增高，可因脉络膜新生血管、视网膜色素上皮脱离和黄斑部出血导致视力迅速下降或丧失。其发生与视网膜色素上皮(RPE)老年性改变密切相关。已有的研究发现，RPE细胞吞噬溶酶体中脂褐素的不断积聚有可能导致了RPE的衰老及凋亡。如何阻止或预防RPE的老年性改变，恢复RPE的活性，对防治和预防AMD的发生具有重要的临床意义。盐酸甲氯芬酯是临床使用多年的中枢神经系统兴奋药，具有清除细胞内氧自由基和脂褐素、保护细胞膜等作用。本实验旨在通过建立RPE细胞脂褐素形成的模型，观察盐酸甲氯芬酯对人RPE脂褐素的清除作用及其对RPE增生的影响。 方法：(1)采用梯度离心法制备猪眼光感受器外节(POS)，将POS与人RPE共培养3周，建立猪POS诱导的人RPE脂褐素形成模型，通过流式细胞术、荧光显微镜照相以及电镜技术定性及定量记录脂褐素的形成。(2)通过流式细胞术、MTT比色法和核仁嗜银蛋白染色分析，观察10～1000mg/L盐酸甲氯芬酯作用于人RPE12、24、36、48、72h后对其脂褐素及细胞增生的影响。 结果：(1)与POS共培养1、2和3周的RPE脂褐素自发荧光值分别为9.12±0.71、11.05±0.89和12.38±0.60；未与POS共培养的RPE脂褐素自发荧光值分别为3.68±0.33、3.75±0.44和3.82±0.35，两组相比P＜0.01。荧光显微镜下实验组细胞自发荧光强度随培养时间延长而增强，电子显微镜下也可见实验组细胞内脂褐素增多。(2)10～1000mg/L盐酸甲氯芬酯作用于人RPE12、24、36、48、72h后可以清除人RPE细胞内的脂褐素。10mg/L盐酸甲氯芬酯作用12h后RPE脂褐素自发荧光值为10.44±0.48，空白对照组RPE脂褐素自发荧光值为12.08±0.28，两组相比P＜0.01；10～1000mg/L盐酸甲氯芬酯作用于人RPE12、24、36、48、72h后可以促进RPE增生。MTT结果：自12h起各浓度盐酸甲氯芬酯组与对照组光吸收值均相差显著(P＜0.01)；嗜银蛋白染色结果：10mg/L盐酸甲氯芬酯作用24h后其胞核内AgNORs平均数为2.0，与对照组相比P＜0.05；1000mg/L盐酸甲氯芬酯作用12h胞核内AgNORs平均数为2.0，与对照组相比P＜0.05。 结论：将人RPE与猪POS共培养，促使了细胞内脂褐素的形成和蓄积，其过程周期短、操作简单、重复性强，可以作为体外培养的人RPE脂褐素形成模型；盐酸甲氯芬酯可以清除人RPE细胞内的脂褐素，促进RPE增生，并与剂量和作用时间有一定的关系。国内未见相关报道。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

文献回顾

第一部分猪光感受器外节诱导人视网膜色素上皮细胞脂褐素的形成

第二部分盐酸甲氯芬酯对人视网膜色素上皮细胞脂褐素的清除作用

4参考文献

附 图

小 结

致 谢