白细胞介素-10在人牙囊细胞中的表达及其对牙齿萌出作用的机制研究

摘要

在临床上，口腔医生常常会遇到由于牙齿萌出异常所致的牙齿迟萌或阻生的病例。临床资料表明，牙齿阻生的发生率为5.6-18.8％。迄今为止，已经发现25 种综合征与牙齿萌出异常有关。牙齿萌出是一个非常复杂且受到严密调控的过程，需要牙齿组织、牙囊和牙槽骨中的各种细胞在特定时期行使一定的功能，并且共同发挥作用。牙囊是包绕成釉器周围的疏松结缔组织，起源于外胚间充质，在牙齿萌出和牙周组织形成中发挥着重要的作用。研究表明，缺乏牙囊的牙齿不能萌出。牙囊参与调控牙齿萌出过程，包括趋化单核细胞在牙囊内聚集以及促进单核细胞分化成破骨细胞，进而在牙槽骨内发生破骨细胞性骨吸收，形成牙齿萌出通道。 牙齿萌出过程受到许多细胞因子的调控，如集落刺激因子-1（CSF-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、甲状旁腺素相关蛋白（PTHrP）、白细胞介素-1α（IL-1α）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、骨保护素（OPG）、破骨细胞分化因子（RANKL）等等。这些因子对于牙齿萌出过程发挥着重要作用，其诱导作用原理以及因子之间相互作用调控牙齿萌出的机理成为目前研究的热点。CSF-1 和MCP-1 可以趋化单核细胞进入牙囊。 OPG和RANKL 是破骨细胞形成的关键因子。以往的研究表明，牙齿萌出过程是通过RANKL-RANK /OPG 途径进行的。 白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10），也被称为细胞因子合成抑制因子，是由T 细胞、巨噬细胞、单核细胞和B 细胞分泌的。人牙周膜细胞和大鼠牙囊细胞也分泌IL-10。研究表明IL-10 不仅具有很强的抗炎及免疫抑制活性，还可以抑制破骨细胞形成，从而抑制牙槽骨的破骨细胞性骨吸收。IL-10基因敲除小鼠的牙槽骨吸收加速。那么IL-10 是否参与了牙齿萌出时的破骨作用发生过程？如果IL-10 参与了牙齿萌出过程，它又能调控哪些因子发挥作用？ 本研究通过体外培养人牙囊细胞，采用细胞生物学和分子生物学的有关方法，研究IL-10 在人牙囊细胞中的表达及其对牙齿萌出作用的机制。首次证明了IL-10 在人牙囊细胞中的表达；观察了IL-10 对人牙囊细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响；研究了IL-10 对人牙囊细胞破骨相关因子：CSF-1、MCP-1、OPG 和RANKL 表达的影响，以及IL-10 作用于OPG 和RANKL 的信号转导途径。本研究有助于阐明IL-10 参与牙齿萌出的生物学机制，对于临床上治疗和预防牙齿萌出异常所致的畸形与疾病具有重要的指导意义。研究内容如下： 第一部分：人牙囊细胞的体外培养及鉴定 目的：原代培养人牙囊细胞，并鉴定其细胞来源。 方法：取因正畸需要而拔除的牙根尚未发育完全、牙齿尚未萌出的健康青少年下颌第三磨牙的牙囊，进行原代培养，观察细胞形态。取生长状态良好的第5 代人牙囊细胞进行波形丝蛋白和角蛋白免疫组化染色，鉴定其细胞来源。 结果：细胞形态呈长梭形和多角形，波形丝蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性。 结论：人牙囊细胞来源于外胚间充质，具有成纤维细胞的形态特征。 第二部分：IL-10 在人牙囊细胞中的表达 目的：检测IL-10 在人牙囊细胞中的表达。 方法：取生长状态良好的第5代人牙囊细胞，采用RT-PCR 法检测IL-10 mRNA 在人牙囊细胞中的表达；采用免疫组化染色检测IL-10 蛋白在人牙囊细胞中的表达； 结果：IL-10 mRNA和蛋白在人牙囊细胞中表达呈阳性。 结论：人牙囊细胞表达IL-10。 第三部分：IL-10 对人牙囊细胞生物学特性的影响 目的：检测IL-10对人牙囊细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。 方法：取生长状态良好的第5代人牙囊细胞，加入0、1、10、25、50、100ng/mlIL-10，分别用MTT法检测IL-10对人牙囊细胞增殖影响的浓度效应，用碱性磷酸酶试剂盒检测IL-10对人牙囊细胞碱性磷酸酶活性影响的浓度效应。加入10ng/mlIL-10作用0d、1d、3d、5d、7d，分别检测IL-10对人牙囊细胞增殖影响的时间效应以及IL-10对人牙囊细胞碱性磷酸酶活性影响的时间效应。 结果：不同浓度的IL-10对人牙囊细胞的增殖影响无显著性差异；10ng/mlIL-10作用于不同时间对人牙囊细胞的增殖影响无显著性差异。10、25、50、100ng/mlIL-10降低人牙囊细胞的碱性磷酸酶活性；10ng/mlIL-10作用3-7d降低人牙囊细胞的碱性磷酸酶活性。 结论： IL-10对人牙囊细胞的增殖无影响。IL-10降低人牙囊细胞的碱性磷酸酶活性，说明IL-10抑制人牙囊细胞向成骨方向分化。 第四部分：IL-10 对人牙囊细胞破骨相关因子表达的影响 目的：研究IL-10 对人牙囊细胞破骨相关因子：CSF-1、MCP-1、OPG、RANKL 表达的影响。 方法：取生长状态良好的第5 代人牙囊细胞，加入25ng/mlIL-10 作用0h、1h、3h、6h、9h、12h，用RT-PCR 法分别检测CSF-1、MCP-1、OPG、RANKL mRNA 表达的变化。取生长状态良好的第5 代人牙囊细胞，加入25ng/mlIL-10 作用0h、2h、4h、6h、8h，用ELISA 法分别检测上清液中CSF-1 和MCP-1 蛋白的含量；用Western Blot 法分别检测OPG和RANKL 蛋白的含量。 结果：CSF-1 mRNA 表达在3-12h 降低，蛋白分泌在6-8h 减少。MCP-1 mRNA 表达在1-6h 降低，蛋白分泌在4-8h 减少。OPGmRNA 表达在1-6h 增加，蛋白表达在2-8h 增加。RANKL mRNA 表达在3-12h降低，蛋白表达在4-8h 减少。 结论：IL-10 通过降低人牙囊细胞CSF-1 和MCP-1的表达，在牙齿萌出过程中对单核细胞在牙囊中的趋化发挥抑制作用，因此阻碍单核细胞进一步分化成破骨细胞，从而抑制破骨细胞吸收牙槽骨，形成牙齿萌出通道。IL-10 通过增加人牙囊细胞OPG 的表达，降低RANKL的表达，抑制牙槽骨的破骨细胞性骨吸收，在非牙齿萌出的特定时期发挥作用，而且IL-10 自身也能抑制破骨细胞性骨吸收，这样对于非牙齿萌出的特定时期牙槽骨保持正常状态具有非常重要的意义。 第五部分IL-10 对人牙囊细胞OPG 和RANKL 作用的信号转导途径 目的：研究IL-10 对人牙囊细胞OPG 和RANKL 作用的信号转导途径。 方法：取生长状态良好的第5 代人牙囊细胞，加入25ng/ml IL-10 和/或5μg/mldbcAMP（PKA 激动剂）；112nM KT5720（PKA 抑制剂）；50ng/ml PMA（PKC激动剂），1μM Go6983（PKC 抑制剂）于6h 终止培养。采用RT-PCR 方法检测PKA、PKC 激动剂和抑制剂对IL-10 作用下人牙囊细胞OPG 和RANKLmRNA 表达的影响。 结果：dbcAMP 和KT5720 对IL-10 作用下OPG mRNA的表达无影响；但是，dbcAMP 增加IL-10 对RANKL mRNA 表达的作用，KT5720 降低IL-10 对RANKL mRNA 表达的作用。相反的是，PMA 和Go6983对IL-10 作用下RANKL mRNA 的表达无影响；但是，PMA 增加IL-10 对OPGmRNA 表达的作用，Go6983 降低IL-10 对OPG mRNA 表达的作用。 结论：在人牙囊细胞中，IL-10 对OPG mRNA 表达的作用是通过PKC 途径进行的，而对RANKL mRNA 表达的作用是通过PKA 途径进行的。