体外培养人牙囊细胞中OPG和RANKL的表达及其对牙齿萌出的作用

摘要

牙囊组织起源于外胚间充质，是包绕成釉器周围的疏松结缔组织，在牙齿萌出和牙周组织形成中起重要作用，缺乏牙囊的牙齿不能萌出，而单核细胞在牙囊的聚集以及单核细胞分化成破骨细胞、进而吸收牙槽骨、形成牙齿萌出通道是牙齿萌出的关键。这个过程受许多细胞因子的调控，如集落刺激因子-1(CSF-1)、甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-1α(IL-1α)、上皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、骨保护素(OPG)、破骨细胞分化因子(RANKL)等，这些因子直接或者间接诱导单核细胞进入牙囊。Wise等研究发现在特定时期鼠牙囊细胞中OPG表达会下降，实验证明这种下降是由CSF-1和PTHrP介导的，他们下调OPG的表达，使RANKL/OPG比例升高，进而促进破骨细胞形成、牙槽骨吸收、牙齿萌出。 对于牙囊细胞是否表达RANKL一直存在争议，2004年YAO等采用激光捕获微显微切割技术和RT-PCR技术证明了鼠牙囊细胞中存在RANKL的表达，因此推测牙齿萌出所需的局部环境中的破骨细胞形成是由RANKL、OPG、CSF-1和PTHrP等相互作用来调节的，但是具体机制还不清楚，有待于深入研究阐明。 成骨与破骨在骨代谢中是密不可分的，两者也同时存在于牙齿萌出这个特殊的骨代谢过程中，骨形成蛋白-2(BMP-2)作为一种重要的成骨相关蛋白，在这个过程中又是如何发挥作用的呢?对这方面的研究国内外鲜见报道。 本实验通过青少年第三磨牙牙囊细胞的培养，结合分子生物学技术，首次证明了人牙囊细胞中存在OPG和RANKL基因的表达；观察了CSF-1、PTHrP和BMP-2对人牙囊细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性的影响；以及对人牙囊细胞中OPG和RANKL基因表达的影响；建立了人牙囊细胞与人外周血单核细胞的共培养体系，证实了人牙囊细胞表达的OPG和RANKL在破骨细胞分化中的作用；结果有助于阐明牙齿萌出的分子机制，也为临床阻生牙的正畸矫治以及牙胚的组织工程研究提供理论基础。研究内容如下： 第一部分：体外人牙囊细胞的培养及鉴定目的：原代培养人牙囊细胞，并鉴定其细胞来源。方法：取因正畸需要而拔除的牙根尚未发育完全、牙齿尚未萌出的健康青少年下颌第三磨牙的牙囊，进行原代培养，观察细胞形态，第5代细胞进行波形丝蛋白和角蛋白免疫组化染色鉴定其细胞来源。结果：细胞形态呈多形性：有长梭形、纺锤形、不规则三角形等，波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。结论：人牙囊细胞来源于外胚间充质，细胞呈多形性。 第二部分：CSF-1、PTHrP和BMP-2对体外培养人牙囊细胞生物学特性的影响目的：检测CSF-1、PTHrP和BMP-2对体外培养人牙囊细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性的影响。方法：第5代人牙囊细胞接种于96孔培养板上，分别与不同浓度的CSF-1、PTHrP和BMP-2共同孵育，检测三种细胞因子对人牙囊细胞的增殖活性和碱性磷酸酶活性的影响。结果：25ng/mlCSF-1、10ng/mlPTHrP、100ng/mlBMP-2促增殖作用最强，并且第3～5d促增殖效果最显著。CSF-1和BMP-2可提高人牙囊细胞的碱性磷酸酶活性，PTHrP降低人牙囊细胞的碱性磷酸酶活性。结论：特定浓度下CSF-1、PTHrP和BMP-2对人牙囊细胞的增殖均有促进作用；CSF-1和BMP-2可刺激人牙囊细胞向成骨方向分化，PTHrP无此作用。 第三部分：CSF-1、PTHrP和BMP-2对体外培养人牙囊细胞表达OPG、RANKL的影响目的：研究CSF-1、PTHrP和BMP-2对体外培养人牙囊细胞表达OPG和RANKL的影响。方法：第5代人牙囊细胞免疫组化染色，检测人牙囊细胞中OPG和RANKL蛋白的表达；第5代人牙囊细胞分别与浓度为25ng/mL的CSF-1和10ng/mL的PTHrP共同孵育0h、0.5h、1h、3h、6h、12h；与浓度为100ng/mL的BMP-2共同孵育0h、1h、3h、6h、12h、18h，夹心ELISA法检测上清液中OPG的含量，RT-PCR法检测OPG和RANKL基因表达的变化。结果：人牙囊细胞OPG、RANKL免疫组化染色阳性；25ng/mL的CSF-1和10ng/mL的PTHrP可下调OPG蛋白的分泌，最佳效应时间为1h，上调RANKL基因的表达，最佳效应时间为3h，100ng/mL的BMP-2则作用相反，上调OPG蛋白的分泌，最佳效应时间为12～18h，下调RANKL基因的表达，最佳效应时间为6～12h。结论：人牙囊细胞存在OPG、RANKL蛋白的表达;CSF-1和PTHrP可降低人牙囊细胞OPG蛋白的分泌及基因的表达，同时可增强RANKL基因的表达，提高RANKL/OPG的比值，促进破骨细胞的形成；而BMP-2可增强人牙囊细胞OPG蛋白分泌和基因表达，减弱RANKL基因的表达，降低RANKL/OPG的比值，抑制破骨细胞的形成。 第四部分：体外培养人牙囊细胞表达的OPG和RANKL对破骨细胞表型分化的影响目的：建立人牙囊细胞与人外周血单核细胞共培养体系，研究体外培养人牙囊细胞表达的OPG和RANKL对破骨细胞表型分化的影响。方法：取健康成人外周血分离出单核细胞，接种于24孔板上，1640培养液培养，每个孔内放置不锈钢网架，上面放置一个长有人牙囊细胞的玻片，建立两种细胞共培养体系，培养液相通，而细胞不相接触，观察两种细胞生长情况。实验分七组：A、单核细胞；B、单核细胞+牙囊细胞(接触)；C、单核细胞+牙囊细胞(接触)+CSF-1+PTHrP；D、单核细胞+牙囊细胞(不接触)；E、单核细胞+RANKL+CSF-1；F、单核细胞+RANKL+CSF-1+牙囊细胞(不接触)；G、单核细胞+RANKL+CSF-1+牙囊细胞(不接触)+anti-OPG。把每组的细胞接种到预置玻片和牙本质片的24孔板中培养，观察细胞变化。培养第10d，取出玻片，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，计数每组TRAP染色阳性细胞；第14d取出牙本质片，扫描电镜下观察骨陷窝形成情况。结果：B、F组可见少量破骨样细胞，A、D组无破骨样细胞，E组破骨样细胞分化最显著，C、G组破骨样细胞较E组略少，但无显著性差别，与其他各组差别显著。结论：建立了培养液相通而细胞不接触的人牙囊细胞与人外周血单核细胞共培养体系；证明体外培养人牙囊细胞表达的RANKL和OPG分别对破骨细胞表型分化具有正向和负向影响。

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缩略语表

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前言

文献回顾牙齿萌出过程中细胞、分子、基因的调控

实验部分

第一部分:体外人牙囊细胞的培养及鉴定

第二部分CSF-1、PTHrP和BMP-2对体外培养人牙囊细胞生物学特性的影响

第三部分：CSF-1、PTHrP和BMP-2对体外培养人牙囊细胞表达OPG、RANKL的影响

第四部分：体外培养人牙囊细胞表达的OPG和RANKL对破骨细胞表型分化的影响

全文总结

参考文献

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