Basigin/CD147在人神经胶质瘤侵袭中的作用机制及其反义RNA抑制神经胶质瘤侵袭的实验研究

摘要

胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤，占颅内肿瘤的35.26％～60.96％，平均44.69％，目前尚无根治方法。胶质瘤具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特点。恶性胶质瘤预后极差，中位生存时间少于18个月，2年存活率约为5％。胶质瘤多呈浸润性生长，手术难以全切，需结合放疗、化疗、生物治疗等综合治疗手段以延长病人生存期。随着影像学技术的发展，胶质瘤的诊断、治疗取得了一定进展，但总体疗效并未实现突破。因此，神经胶质瘤是神经外科的难题和医学研究的重要课题之一。 造成神经胶质瘤死亡率高的主要原因是神经胶质瘤的高侵袭性。其侵袭过程中的一个重要因素是细胞外基质的降解，其中，起重要作用的是一类Zn2+依赖的基质金属蛋白酶MMPs（Matrix metalloproteinases）。MMPs能够破坏局部组织结构和基底膜屏障，促进肿瘤生长和转移，并且可促进肿瘤新生血管的形成。CD147作为MMPs的诱导因子，是一个广泛表达的质膜糖蛋白，参与机体多种生理和病理过程。CD147分子表达于许多正常细胞类型，包括成体和胚胎组织。它在炎症的发生发展、病毒的易化介导、细胞之间的黏附及胚胎发育等方面起着一定的作用。研究证实，CD147表达于各种肿瘤组织特别是恶性肿瘤，如乳腺癌、肺癌、肾癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤等，同时其表达较相应正常组织明显要高。 近年来一些研究发现在中枢神经系统，CD147表达于血脑屏障内皮细胞、脉络膜上皮细胞和视网膜色素上皮细胞，并在血脑屏障中起作用。但缺乏CD147分子在神经系统及神经系统肿瘤中表达的系统性研究。以往研究虽然表明CD147功能上与某些恶性肿瘤，如肝癌存在相关性，提示其在致病机制上是一个非常重要的因子，但更明确的作用机制还需要进一步深入探讨。另外，CD147在神经系统肿瘤，尤其是神经胶质瘤侵袭中的作用如何还不明确。 本研究收集了18例神经胶质瘤样本，并采用63点胶质瘤组织芯片检测Basigin/CD147在人脑组织及神经胶质瘤组织中的表达情况。分别在组织水平及基因水平分析了Basigin/CD147的表达与临床病理学特征的关系；构建Basigin/CD147反义RNA表达载体，建立并筛选低表达CD147的重组人神经胶质瘤细胞株U251/147的克隆；并进一步采用反义RNA技术研究Basigin/CD147在胶质瘤侵袭、血管形成方面的作用及机制。 第一部分：Basigin/CD147 在人神经胶质瘤组织中的表达及临床意义。 收集了18例神经胶质瘤样本，并采用63点胶质瘤组织芯片检测CD147的表达情况。结果发现，神经胶质瘤组织中Basigin/CD147表达于肿瘤细胞膜和细胞质中，但未见细胞核染色。神经胶质瘤组织中Basigin/CD147蛋白的阳性表达率为74.3％。而正常脑组织中仅血管内皮细胞浆有阳性着色，神经细胞及神经胶质细胞未见表达。表明在正常脑组织中CD147仅表达于血管内皮。此研究结果说明与正常脑组织相比，神经胶质瘤组织中Basigin/CD147存在过度表达。不同级别胶质瘤细胞着色结果分析发现，在胶质瘤细胞胞浆中有CD147着色，并且高级别星型胶质瘤（III、IV级）瘤细胞胞浆CD147着色显著强于低级别星型胶质瘤（I、II级）。说明胶质瘤细胞不仅表达CD147，并且其表达程度与胶质瘤恶性程度成正比。 胶质瘤组织RT-PCR结果显示，Basigin/CD147mRNA的表达在神经胶质瘤组织中阳性率为83.3％，明显高于正常脑组织中的阳性率25％（P<0.05）。在阳性表达病理中，对Basigin/CD147mRNA的RT-PCR产物进行半定量测定（Basigin/β-actin），结果显示Basigin/CD147mRNA在神经胶质瘤组织中的表达量为0.274±0.087，明显高于正常组织0.081±0.043，两者具有显著性差异（P<0.05）。此结果提示Basigin/CD147的表达与神经胶质瘤的发生有关。 第二部分：Basigin/CD147 反义RNA表达载体的建立及重组人神经胶质瘤细胞株U251/147的克隆建立及筛选。 构建了Basigin/CD147反义RNA质粒,用反义RNA特异封闭肿瘤细胞的Mrna, 封闭胶质瘤细胞表面Basigin/CD147的表达, 从而抑制其刺激肿瘤细胞分泌MMPs，进而抑制胶质瘤细胞的侵袭。我们选择表达Basigin/CD147的U251细胞系作为反义核酸的封闭靶点，进而研究其被抑制后的生物学变化。实验结果表明，当PCI-147重组质粒转染人神经胶质瘤细胞U251后，转染细胞的流式细胞检测结果证实细胞膜表面荧光强度减弱。Western Blot检测结果也证实Basigin/CD147表达降低。这些变化主要是由于反义RNA与CD147mRNA结合，阻碍了其翻译过程，封闭了Basigin/CD147分子的表达。 第三部分：Basigin/CD147反义核酸对人神经胶质瘤细胞U251侵袭转移能力的影响。 明胶酶谱实验发现，U251/147细胞分泌的MMP-2和MMP-9显著低于U251细胞和U251/neo细胞。说明CD147反义核酸的确影响了U251细胞明胶酶的分泌。U251/147细胞培养上清中VEGF水平显著低于U251细胞和U251/neo细胞，分别降低了37.61％和42.76％，说明CD147有促进胶质瘤细胞VEGF分泌的作用，而CD147反义核酸抑制了U251细胞VEGF的分泌。重组基底膜实验中可以看出，U251/147细胞侵袭人工重组基底膜的数目显著少于U251细胞和U251/neo细胞，U251/147细胞的穿膜数较U251细胞和U251/neo细胞分别降低了65.8％和70.1％，表现出细胞侵袭能力的降低。细胞划伤实验中，U251/147细胞的运动细胞数显著低于U251细胞，说明U251/147细胞的运动能力显著低于U251细胞，CD147反义核酸显著降低了U251细胞的运动能力。