MN9202手性对映体对心肌细胞作用的差异性及其对内毒素致心肌损伤的保护作用与机制

摘要

目的：①建立MN9202 手性固定相HPLC 拆分方法，制备单一对映体，比较MN9202 对映体对心肌细胞收缩、舒张功能及钙瞬变的影响，及其对离子通道的立体选择性；②探讨MN9202 对心肌的保护作用及其机制。为正确评价MN9202 消旋体及其对映体作用的差异性，为二氢吡啶类钙通道拮抗剂的临床应用提供科学依据。 方法：①采用Daicel OJ-H 手性固定相色谱柱，通过对流动相中正己烷与乙醇的比例、添加三乙胺的量对MN9202 对映体的保留时间及分离度的影响进行考察，优化色谱条件，拆分MN9202 消旋体。②采用IonOptix 单细胞动缘探测系统同步检测MN9202 消旋体、S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202 作用后心肌细胞收缩、舒张和钙瞬变的变化。③采用全细胞膜片钳方法，比较MN9202 消旋体、S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202 对心肌细胞L 型钙通道电流密度的影响。进而探讨各药物对L 型钙通道稳态激活动力学和稳态失活动力学特性的影响。④通过股静脉注射LPS 建立感染性休克致动物心肌损伤模型，研究MN9202 对心肌的保护作用；RM-6200 型四道生理记录仪实时监测血压等参数；用ELISA 法测定血浆TNF-α水平；取心肌组织样本，进行HE 染色，比较心肌形态学改变。⑤原代培养新生大鼠心肌细胞，用LPS 和不同浓度的MN9202 消旋体、对映体及氨氯地平作用，采用ELISA 法测定培养上清液中TNF-α含量，RT-PCR 及免疫荧光法分别测定心肌细胞中TNF-αmRNA 和蛋白的表达。⑥ RT-PCR 和western blot 法分别测定LPS 刺激不同时间及DHPs 作用后心肌细胞iNOS、COX-2 mRNA 和蛋白的表达。Westernblot 法测定磷酸化Akt 和总Akt 的表达。 结果: ①本研究建立的MN9202 HPLC 手性拆分条件为：Daicel OJ-H 手性分析柱，正己烷-乙醇-三乙胺（93︰7︰0.5，V︰V︰V）为流动相，流速为0.5ml/min，检测波长为237 nm。用此法MN9202 对映异构体可达到基线分离，并可少量制备S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202。②不同浓度的MN9202 消旋体和S-(-)-MN9202 可剂量依赖性抑制大鼠单个心肌细胞的收缩：在1×10-5mol/l 浓度时，百分峰值收缩幅度(PTA ％baseline)与对照组相比分别降低了73.8 ％和92.7 ％；而R-(+)-MN9202 则呈剂量依赖性增强心肌细胞的收缩，1×10-5 mol/l 时， PTA ％baseline 升高了18.2 ％ 。MN9202 消旋体和S-(-)-MN9202 剂量依赖性抑制单个心肌细胞钙瞬变幅度（△FFI）。与对照组相比，1×10-5 mol/l MN9202 消旋体和S-(-)-MN9202，细胞钙瞬变分别由0.45±0.04 下降到0.07±0.02，及由0.45±0.04 下降到0.05±0.01（P<0.01）。而R-(+)-MN9202 则增加了钙瞬变幅度：在最大浓度1×10-5 mol/l 时，细胞钙瞬变由0.45±0.01 升高到0.58±0.05（P<0.01）。③ MN9202 消旋体剂量依赖性的降低了L 型钙通道电流密度。检测电压为0 mV，MN9202 浓度为0.03、0.1、0.3、1 和3 μmol/l 时，CaL 电流峰值的密度较对照组分别减少了6.7 ％、15.0 ％（P<0.01）、27.5 ％（P<0.01）、50.7 ％（P<0.01）和69.5 ％（P<0.01）；但药物并未改变L 型钙通道激活的阈电位（-40 mV）和峰值电流电位（0 mV）。S-(-)-MN9202 也抑制了L 型钙通道电流密度，检测电压为0 mV 时，1 μmol/lS-(-)-MN9202 使CaL 电流峰值的密度从对照组的-9.8±1.0 减少到-3.2±0.9（减少了67 ％）（P<0.01）。而1 μmol/l R-(+)-MN9202 则引起了L 型钙通道电流密度增加：检测电压为0 mV 时，使CaL 电流峰值的密度从对照组的-9.3±0.7增加到-10.3±0.6（P<0.01）。MN9202 消旋体，S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202均未明显改变L 型钙通道的激活特性。但各药物均对通道稳态失活有一定的影响： MN9202 消旋体和S-(-)-MN9202 均使稳态失活曲线左移，而R-(+)-MN9202 使稳态失活曲线轻微右移。④ LPS 在30 min 内引起大鼠平均动脉压的快速下降，从119±4 降至85±2 mmHg（P<0.05）；60 min 后，大鼠平均动脉压仍持续下降，在240 min 时为81±3 mmHg。10 及30 μg/kg MN9202消旋体给药后，延缓了LPS 对大鼠平均动脉压的下降。但MN9202 的应用并未改变LPS 对心率的影响。给予LPS 使血浆中TNF-α的水平发生了变化，先升高，至1 小时达到峰值，而后逐渐降低。MN9202 给药后可使LPS 引起的大鼠血浆TNF-α升高的峰值显著降低（P<0.05）。⑤正常心肌细胞几乎不表达TNF-α，但细胞培养液中TNF-α的含量可随LPS 浓度的增加而提高；TNF-α的释放与mRNA 表达也随着LPS 刺激时间的延长而显著升高，在刺激后12 小时达高峰。0.1 ~ 10 μmol/l 的氨氯地平、MN9202 消旋体、R-(+)-MN9202 对映体可浓度依赖性的抑制LPS 刺激的TNF-α的释放和mRNA 的表达，S-(-)-MN9202 对映体对TNF-α的释放及mRNA 的表达无明显影响。1.0 μmol/l 的氨氯地平、MN9202 消旋体、R-(+)-MN9202、S-(-)-MN9202对TNF-α释放的抑制率分别为52.41、31.62、49.81 和2.25 ％。⑥ MN9202消旋体可浓度依赖性地抑制LPS 刺激所致iNOS 和COX-2 转录和翻译水平的表达；1.0 μmol/l 的MN9202 消旋体对COX-2 的抑制作用与氨氯地平相当，对iNOS 的抑制作用强于氨氯地平；R-(+)-MN9202 明显抑制iNOS 和COX-2的表达（P<0.05），而S-(-)-MN9202 对iNOS 和COX-2 的表达均无影响。⑦LPS 刺激的同时，用MN9202 消旋体、R-(+)-MN9202 对映体或氨氯地平处理心肌细胞，均可明显增加pAkt 的表达（P<0.05）；但S-(-)-MN9202 对Akt的活化无明显影响。用PI3K 抑制剂wortmannin 或LY294002 预处理2 h 后，LPS 和DHPs（MN9202 消旋体、R-(+)-MN9202 对映体和氨氯地平）共处理心肌细胞，各DHPs 处理组Akt 的活化均受到抑制；3 种DHPs 类化合物对TNF-α释放的抑制作用均可被wortmannin 或LY294002 不同程度的降低；Cox-2 和iNOS 蛋白的表达与无PI3K 抑制剂预处理组相比无显著性差异。 结论: ①本研究建立的手性固定相拆分条件为MN9202 单一对映异构体的分离、制备及含量测定等提供了简单、快捷的方法。②两种MN9202 对映体对心肌细胞收缩与舒张特性、钙瞬变和L 型钙通道均具有立体选择性。S-(-)-MN9202 表现出了拮抗特性，而R-(+)-MN9202 则具有一定的激动活性。③ MN9202 对LPS 致大鼠心肌损伤有保护作用，此作用与其抑制LPS 引起的TNF-α、iNOS 和COX-2 表达升高密切相关，其中R-(+)-MN9202 是抑制炎症相关基因表达的优映体。④ MN9202 通过激活PI3K，引起下游Akt 的活化，参与了TNF-α的调节过程，但对Cox-2 和iNOS 的调节作用可能依赖于其它信号转导通路。