环氧氯丙烷处理组织工程瓣膜的实验研究

摘要

目的：目前，组织工程心脏瓣膜(TEHV)研究是瓣膜外科的热点之一，生物支架材料仍存在的钙化及衰坏等缺陷，获取具有相应功能的活性种子细胞是急待解决的问题。环氧氯丙烷（EC）是西京医院筛选的生物瓣膜防钙化剂，应用其处理的猪主动脉瓣防钙化效果明显。然而EC 处理对支架材料的理化性质及血液相容性，仍然研究未明。本研究针对EC 处理的TEHV 去细胞支架材料的防钙化效果、理化性质及血液相容性予以评价。同时，本课题取材人骨髓，分离得到内皮祖细胞（EPCs）和骨髓间充质干细胞（MSCs），体外培养、扩增、分化，并进行功能鉴定。探讨其作为种子细胞，构建TEHV 的可行性和条件，为新型组织工程心脏瓣膜种子细胞的选择提供实验基础。 方法： 1．采用改变渗透压和酶消化的方法制备去细胞猪主动脉瓣支架材料，HE 染色鉴定其细胞去除情况。分别对EC 处理、GA 处理、二者联合处理及未经处理的去细胞猪主动脉瓣支架材料行茚三酮实验，胶原酶消化实验，血浆蛋白吸附实验以及血小板黏附实验，以分别探讨EC 对去细胞支架材料的胶原交联度及血液相容性的影响。将支架材料植入SD 大鼠体内包埋60 天后取出行HE染色及免疫组化，观察支架材料钙化程度。 2．取材骨髓，分离得到内皮祖细胞（EPCs）和骨髓间充质干细胞（MSCs），体外培养、扩增、分化。内皮细胞条件培养基培养，纤维粘连蛋白包被培养皿，以EGF、VEGF 等生长因子诱导EPCs 分化，采用免疫组化CD31、Ⅷ因子相关抗原染色、乙酰化低密度脂蛋白（DiI-Ac-LDL）摄取试验分析评价内皮细胞功能；DMEM 培养基培养扩增，以5-Aza 诱导MSCs 分化，采用α-SMA、Vimentin 免疫组化染色鉴定其分化表达，以免疫组化Ⅰ、Ⅲ胶原染色评价其分泌功能，以探讨EPCs 和MSCs 作为组织工程瓣膜种子细胞的可能。 结果： 1．应用胰蛋白酶、去垢剂和改变渗透压的方法处理新鲜猪主动脉瓣，得到去细胞猪主动脉瓣支架材料。HE 染色显示其瓣叶、管壁及平滑肌中的细胞成分均被基本去除了，而未经去细胞处理的支架材料瓣叶、管壁及平滑肌中则存在大量细胞成分。体内包埋实验结果显示EC 处理的支架材料未见明显钙化灶，少有结缔组织包绕，而GA 处理的对照组支架材料组织钙化明显。去细胞猪瓣支架材料经EC 或GA 处理后，较未处理组茚三酮值均明显下降(p <0.01)，GA 处理后的去细胞猪瓣支架材料经EC 再处理后，较单用GA 处理组茚三酮值进一步下降(p <0.01)。单用EC 处理瓣膜的交联度小于GA 处理胶原蛋白的交联度，但EC 处理能使GA 处理的瓣膜交联度进一步增加(p <0.01)。去细胞猪瓣支架材料经EC或GA 处理后，未消化率较未处理组明显增加(p <0.01)，GA 处理后的去细胞猪瓣支架材料经EC 处理后，未消化率进一步增加(p<0.01)，其抗消化能力也进一步增强。去细胞猪瓣支架材料经GA处理后蛋白质吸附率较未处理组明显升高，而再经EC 处理后蛋白质吸附率较GA 处理组明显下降（p <0.01），同时显著低于未处理组（p <0.01）。单用EC 处理组蛋白吸附率较未处理组低，但无显著差异。GA 处理的去细胞猪瓣支架材料血小板黏附率较未处理组显著升高（p <0.01），而经EC 再处理后血小板黏附率可明显下降（p <0.01）。EC 处理组血小板黏附，率较未处理组低，但两者无显著差异。 2．从骨髓中可以分离得到EPCs 和MSCs。内皮细胞条件培养的EPCs 呈短梭形及多角形，14 d 后呈铺路石样生长，表达CD31、Ⅷ因子相关抗原、DiI-Ac-LDL 摄取试验阳性。原代培养的MSCs 呈多角形或梭形，4-7 天后呈集落样生长，其α-SMA、Vimentin、Ⅰ、Ⅲ胶原染色均为阳性，提示可以分化为肌纤维母细胞。 结论： 1．本实验针对应用胰蛋白酶、去垢剂和改变渗透压的方法处理得到的去细胞猪主动脉瓣支架材料，行体内包埋实验证明EC 处理法能够有效降低支架材料钙化程度。通过茚三酮实验，胶原酶消化实验分析，EC 能提高去细胞支架材料的胶原交联度。而血浆蛋白吸附实验和血小板黏附实验则验证了EC 处理能够提高去细胞支架材料的血液相容性。EC 处理能够进一步改善去细胞猪瓣支架材料的理化性质，有利于提高血液相容性和减缓钙化，同时对于EC 处理方法在组织工程瓣膜支架材料研究中的应用提供了重要的理论依据。 2．本实验对可能成为组织工程瓣膜的种子细胞进行了诱导分化和功能检测，其形态与细胞表面标记等与文献报道基本相符，通过表达CD31、Ⅷ因子相关抗原免疫组化，DiI-Ac-LDL 摄取试验鉴定，具有分化为内皮样细胞的能力。同时，分离得到MSCs，通过α-SMA、Vimentin 以及Ⅰ、Ⅲ胶原免疫组化等鉴定，具有分化为肌纤维母细胞或平滑肌细胞的能力。因此，骨髓来源的MSCs和EPCs 作为TEHV 种子细胞，显示出巨大的潜能，为TEHV 种子细胞的选择提供了一定的前期实验基础，但仍需进一步仿生环境下培养及植入功能研究。