H5亚型高致病性禽流感病毒重组疫苗构建与评估

摘要

高致病性禽流感近年来一直是我国养禽业的一大威胁，病原变异速度快，流行情况复杂多变。疫苗免疫是控制和预防禽流感的主要手段，但是因为抗原漂移和抗原转变，迫切需要根据流行毒株研制安全性高、针对性强的新疫苗。在禽流感疫苗研究领域，反向遗传操作技术是近几年比较后欢迎的新疫苗制作过程的使用方法，该技术能够在DNA水平上对禽流感病毒基因进行改造或修饰，通过拯救病毒获得毒力减弱的重组毒株，既有利于病毒的体外增值培养，又避免了对自然分离毒株的操作引发的公共安全风险。
　　 本研究通过病毒分离和HA基因序列测定，在全国范围内开展了H5亚型禽流感病毒的流行变异情况调查。结果表明，2007-2010年间分离的毒株主要分布于三个分支中（分别为2.3.4，2.3.2和第7分支），其中2.3.2分支和第7分支的分离株与2007年之前同一分支内的分离株及目前我国广泛使用的疫苗株遗传距离较远。
　　 选取流行毒株M8（2.3.2分支）、KG（2.3.4分支）和J14（第7分支）作为亲本病毒，利用反向遗传技术分别克隆测序了其HA和NA基因，并通过overlapPCR技术对HA基因的裂解位点（H0位点）进行了突变致弱。将NA基因和改造后的HA基因(rHA)分别克隆到pHD载体上，与含有PR86个内部基因的重组质粒共转染HEK293T细胞获得重组病毒，将得到的病毒接种SPF鸡胚收获尿囊液进行HA和HI试验鉴定。结果表明病毒能在鸡胚中繁殖，EID50分别为:10-8.9/0.1mL，10-8.5/0.1mL，10-8.3/0.1mL，HA效价分别为1∶29∶1∶29，1∶28，其血凝性能被H5亚型标准阳性血清抑制，表明重组病毒构建成功，分别命名为rM8，rKG，rJ14。
　　 用甲醛对rM8，rKG，rJ14进行灭活制备疫苗，免疫4周龄SPF鸡，并对这三种疫苗用血凝抑制试验和动物攻毒保护试验进行了疫苗效力评估。结果证实，研制的3种疫苗rM8、rJ14、rKG在免疫21天后平均抗体水平分别为:1∶25.41，1∶24.85，1∶24.4;根据动物试验结果可知，本研究中研制的疫苗免疫鸡群对亲本病毒的保护率均为100％，对异源毒株的保护率0。
　　 用研制出的疫苗和广泛使用的Re5疫苗（疫苗毒株属2.3.4分支）采用了鸡胚病毒中和试验评估，并和血凝抑制和动物攻毒试验结果进行了对比。结果得出，rM8疫苗在鸡体内产生的抗体针对亲本毒株和同源毒株的鸡胚中和试验效价(VN)阈值分别为:21.17和13.67;rKG疫苗在鸡体内产生的抗体针对亲本毒株和同源毒株的鸡胚中和试验
　　 效价(VN)阈值分别为:30.25和7.05;Re5疫苗在鸡体内产生的抗体针对亲本毒株和同源毒株的鸡胚中和试验效价(VN)阈值分别为:25和5;rJ14疫苗在鸡体内产生的抗体针对亲本毒株和同源毒株的鸡胚中和试验效价(VN)阈值分别为:12.44和6.375。结果证实鸡胚病毒中和试验与动物攻毒试验对比存在明显的中和效价阈值，因此可以作为动物攻毒试验的平行方法进行疫苗效果评估。

目录

声明

摘要

前言

1 简介

1．1 病原学

1．2 流行病学

2 流行情况和危害

2．1 禽流感对养禽业的危害

2．2 禽流感对人类的危害

3 禽流感疫苗的研究进展

3．1 灭活疫苗

3．2 基因工程活载体疫苗

3．3 核酸疫苗

3．4 反向遗传技术进行的减毒活疫苗

4 疫苗效力评估方法进展

4．1 国内免疫效力评估方法

4．2 国外免疫效力评估方法

5．本研究的目的和意义

6．创新点

试验一 H5亚型禽流感病毒HA基因变异分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 毒株分离结果

2．2 PCR电泳结果

2．3 HA变异结果进化树

3．讨论

试验二 H5亚型单价疫苗株构建

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 所选H5亚型亲本毒株HA、NA基因扩增与克隆

2．2 HA基因改造结果

2．3 转染与病毒鉴定

2．4 EID50检测结果

3 讨论

试验三 疫苗评估与鸡胚中和试验评估方法的建立

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 攻毒用毒株LD50测定结果

2．2 血凝抑制抗体检测和攻毒保护试验结果

2．3 血清的鸡胚病毒中和试验结果

3．讨论

3．1 关于疫苗效力检验

3．2 关于动物试验、血凝抑制试验和中和试验

全文总结

结论

参考文献

缩略词表

致谢

攻读硕士期间发表论文