表达H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA基因的重组马立克氏病毒的构建及纯化

摘要

高致病性禽流感(High pathogenic．Avian influenza，HPAI)是被国际动物卫生组织列为严格贸易限制性的应报告疾病。近一段时间在我国部分地区出现的高致病性禽流感病毒(HPAIV)毒株均属于H5N1亚型。国际上主要通过扑杀感染动物的方法来控制该病，但是代价巨大；而在我国发生HPAI时采取的防制措施通常以使用灭活疫苗为主，但此类疫苗不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，而且使用过程中受母源抗体的干扰较大。因此迫切需要一种新的疫苗用于HPAI的防制。 以活病毒为载体表达病原体的主要致病基因，不仅可以弥补灭活苗的不足，而且可以同时预防多种疾病，大大降低生产成本，还能产生潜伏感染，引起终生免疫。马立克氏病毒(Marek’s disease virus，MDV)是一种有着广阔应用前景的病毒载体，由于MDV的宿主仅限于鸡和鹌鹑，人们不必担心重组MDV疫苗的使用会带来的AIV基因组重排和变异，所以它具有一定的生态学意义。 本文以MDV Rispens CV1988毒株为载体，构建了表达H5N1亚型高致病性禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组MDV，所构建的重组病毒可成为多联苗的侯选毒株，用于AI和MD的预防和控制。 c 我们选择MDV Rispens CVl988毒株的2个复制非必需区IRS-US和LIS9-US10，PCR扩增复制非必需区两侧序列，并克隆至pCR2.1载体中，分别命名为pCR2.1-1.2(IRS-US复制非必需区)和pCR2.1-3.4 (US9-US10复制非必需区)。以反转录．聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出高致病性禽流感病毒株G5的HA基因，克隆至pCR2.1载体中，命名为pCR2.1-HA。将CMV和gB启动子分别插入到pCR2.1-HA中，构建了质粒pCR2.1-CMV-HA和pCR2.1-gB-HA。采用lac/smGFP作为外源基因插入的标志基因，在标志基因的两侧分别加上loxP序列，构建了质粒 pCR2.1-CMV-HA-GFP和 pCR2.1-gB-HA-GFP。将质粒pCR2-1-CMV-HA-GFP和pCR2.1-gB-HA-GFP中的CMV-HA-GFP和gB-HA-GFP片段分别插入pCR2.1-1.2和pCR2.1-3.4中，成功构建了8个转移载体。将转移载体和MDV Rispens CVI988毒株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞，通过两者在细胞内发生同源重组而将AIV HA基因插入到MDV基因组中。通过标志基因lac/smGFP的表达进行筛选获得重组病毒，挑选荧光反应阳性的病毒空斑，反复传代，直至100％重组病毒感染细胞显示荧光。该重组病毒的获得为HPAI和MD双价苗的研制提供了坚实的基础。

目录

论文说明：符号说明

前 言

第一章含HA基因的转移载体的构建

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二章表达H5亚型HAIV HA基因的重组MDV的获得及纯化

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献

致谢