瘦素(Leptin)基因在山羊不同组织中的表达及在乳腺发育不同时期的甲基化分析

摘要

为了研究Leptin基因的表达对山羊乳腺发育的影响，以及Leptin基因的甲基化与基因表达的关系，本实验采用定量PCR方法对不同时期文登奶山羊、崂山奶山羊、波尔山羊乳腺组织中Leptin基因的表达进行检测，并利用亚硫酸盐测序法，分析了相应时期Leptin基因的甲基化水平，目的是要发现青春期中期、妊娠中期、泌乳期和退化期，文登奶山羊、崂山奶山羊和波尔山羊乳腺组织中Leptin基因的表达以及甲基化的变化规律，揭示Leptin基因在三个不同品种山羊不同发育时期乳腺组织中的甲基化与基因表达的关系。
　　 因为瘦素在动物体的几乎各个器官都表达，分析测定Leptin的分布和含量等信息对了解Leptin的作用至关重要，可以为深入研究Leptin的生物学作用及其机制提供参考。
　　 根据山羊乳腺发育特点，我们分别以青春期中期、妊娠期中期、泌乳中期和退化期四个时期为采样时间点。分别以4个时期文登奶山羊、崂山奶山羊、波尔山羊乳腺组织的cDNA为模板，以β-actin为内参基因，每一组织设3个重复，进行定量PCR扩增，检测Leptin基因的表达情况。Leptin基因的定量结果显示，三个品种的山羊在青春期中期和退化期Leptin的表达量比较高，妊娠中期和泌乳期表达量差不多都明显低于青春期中期和退化期，并且相同品种山羊在乳腺发育的青春期和退化期与妊娠期和泌乳期比较差异情况均显著(p＜0.05).
　　 从总体趋势上看，瘦素基因Leptin在相同的时期不同品种间表达差异情况大体一致，在每个时期瘦素基因的表达量总是:文登奶山羊＞崂山奶山羊＞波尔山羊，且除了在泌乳期文登奶山羊与崂山奶山羊差异不显著(p=0.0675＞0.05)以外别的时期差异均显著(p＜0.05)。
　　 为了分析检测Leptin基因的甲基化情况，分别取文登奶山羊、崂山奶山羊和波尔山羊4个时期的乳腺组织为试验点，采用亚硫酸盐对样本DNA进行处理，测序分析Leptin基因的甲基化水平。文登奶山羊在青春期中期、妊娠中期、泌乳中期、退化期甲基化的CpG位点的数目分别为55、58、58、60;甲基化比率分别78.57％，82.86％，82.86％，85.71％;崂山奶山羊在各个时期甲基化的CpG位点数目分别为59、61、58、60;甲基化比率分别为84.29％，87.14％，82.86％，85.71％。波尔山羊在各个时期的甲基化CpG位点数目分别为:61、60、61、59，甲基化比率为:87.14％，85.71％，87.14％，84.29％。统计后发现，三种山羊在乳腺发育的不同四个时期5'UTRCG位点差不多均被甲基化，而且比率在78％-88％之间。三种山羊无论是在同一时期不同品种之间还是同一品种不同发育时期均无规律性可循。同一品种不同时期间的Leptin基因的甲基化水平不存在差异(p＞0.05);在同一时期不同品种山羊间同样也不存在差异(p＞0.05)。综合瘦素在乳腺中的定量表达情况，我们可以认为这三个品种山羊的Leptin基因的甲基化与其表达均无直接关系。
　　 利用Real-timePCR技术，对瘦素在崂山奶山羊16种不同器官组织的含量进行了检测，分析了其定量表达的情况。结果表明，瘦素在16种器官组织均有表达，表达量最高的是肝脏，最低的是肾脏，表达量从高到低依次为:肝＞心＞小肠＞腿肌＞脾＞皮肤＞乳腺＞肺＞大肠＞血液＞腹脂＞脑＞腹肌＞睾丸＞卵巢＞肾，表明瘦素的表达范围分布广泛不具有组织特异性。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 文献综述

1 乳腺发育的研究情况

1．1 乳腺发育的过程及激素调节

1．2 乳腺发育主要时期特点

1．3 瘦素与乳腺发育

2．荧光定量PCR部分

2．1 荧光定量PCR定义

2．2 定量PCR的种类

2．3 实时定量PCR的应用

3 DNA甲基化概况

3．1 DNA甲基化概念及甲基化原理

3．2 DNA甲基化与基因表达、表观遗传的关系

3．3 DNA甲基化与印迹基因、X染色体失活、胚胎发育、人类疾病

3．4 DNA甲基化与遗传育种

第二部分 试验研究

试验一 瘦素在乳腺中的表达及甲基化情况

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

试验二 瘦素在其它16种不同组织中的定量表达情况

1 材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

结论

参考文献

致谢

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