两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因及其引物和应用

摘要

本发明公开了两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因及其引物和应用。本发明通过从本实验转录组数据以及前人研究的内参基因中筛选出表达较为稳定的13个候选基因，通过geNorm软件对其稳定性进行评估，分析出SKD1与YLS8是两种树形梨叶片在不同发育时期中表达最稳定的一对内参基因组合。本发明提供的内参基因组合能为梨相关功能基因的精确定量提供有力支持，因而具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

梨是世界上极具重要经济价值的落叶果树，良好的整形模式是获得优质果品的重要栽培基础。树形结构可以调节冠层微气候(光照、温度、湿度和其他环境因子)，从而影响光合产物积累和病虫发生率。明确不同树形的结构优点，利用其促进光合产物积累和果实品质提高，一直是梨栽培研究的热点和重点。

梨树是顶端优势明显的树种，树体高大，枝条干性较强。传统的栽培方式为无架树形结构，其主要包括疏散分层形、开心形等。我国上世纪九十年代初开始引进棚架栽培，并在生产实践上不断发展和完善。棚架栽培模式最明显的特征是无中心干，直立枝条被绑缚到架面上，不仅具有通风透光的效果，而且解除了顶端优势，促进花芽分化和果实座果。然而不同树形结构是如何影响梨光合作用相关基因的表达，其分子解析还有待进一步探明。

由于实时定量PCR技术(qRT-PCR)具有精确性高、灵敏度性强和可重复性等特点，目前已成为最为广泛定量基因表达的分子生物学方法。然而qRT-PCR数据的准确性极大的依赖于所选内参基因的稳定性，因此，筛选稳定表达的内参基因成为精确定量目标基因表达量的前提。广泛的研究报道表明常用的内参基因在不同的实验条件下会出现表达不稳定的情况，这很可能导致目的基因检测结果准确性降低。目前没有任何一种内参基因在所有的实验条件下恒定表达。因此，筛选出研究实验条件下最适合的内参基因对目标基因的准确定量至关重要。同时，当评估样本量比较大时，往往单一的内参基因不能准确的进行矫正和标准化，选用多内参组合相对单一内参基因会更为准确。

发明内容

本发明目的是开发一种适合用于梨叶组织在两种树形(棚架树形和疏散分层形)不同发育时期(5月、6月、7月和8月)中的内参基因及其特异性引物，为实现相关功能基因精确定量提供可靠保证；克服了现有技术利用传统单一的内参基因导致不能对目的基因进行准确标准化，进而出现检测结果准确性降低甚至出现错误的问题。

本发明的第一个目的是提供两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因。所述的两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因，其特征在于，为内参基因SKD1和YLS8，所述的内参基因SKD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的内参基因YLS8的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。

本发明的第二个目的是提供上述两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因的特异性引物。所述的两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因的特异性引物，其特征在于，所述的内参基因SKD1的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；所述的内参基因YLS8的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。

本发明的第三个目的是提供所述的内参基因或所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。

优选，所述的试剂盒还包括常规PCR试剂。

所述的内参基因SKD1和YLS8作为两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因的应用，所述的内参基因SKD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述的内参基因YLS8的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。

所述的特异性引物作为两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量特异性引物的应用，所述的内参基因SKD1的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；所述的内参基因YLS8的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。

优选，所述的应用，荧光定量PCR体系为10μL，包含5μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，10μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，cDNA模板0.5μL，加ddH₂O至10μL，体系中的cDNA模板均为1μg>

所述的两种树形是棚架树形和疏散分层形，不同发育时期指5月、6月、7月和8月。

本发明将各候选内参基因qRT-PCR数据导入到geNorm软件中分析，筛选出SKD1与YLS8是两种树形的梨叶组织在不同发育时期中最稳定的一对内参基因组合。本发明提供的内参基因组合能为梨功能基因的精确定量提供有力支持，因而具有重要的应用价值。

本发明利用qRT-PCR技术，建立了两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因的筛选方法及应用，从而获得在此条件下稳定表达的内参基因，并开发了相应的特异性引物。利用此方法筛选出来的内参基因，能够用于快速准确地检测出受不同梨树形调控的相关基因表达水平，弥补了传统未经过评估的单一内参基因作为标准化因子可能导致实验结果准确性不高的问题。通过此方法筛选出来的内参组合精确度和可信度更高，能得到更为可靠的结论，这有助于推动果树树形理论研究，并对未来梨栽培模式的改良创新奠定理论基础。

附图说明

图1是13个候选内参基因片段的PCR扩增产物检测结果；图中M为DNA分子量标记。

图2是13个候选内参基因的熔解曲线。

图3是geNorm软件对13个候选内参基因表达稳定值(M)排序，更低的平均表达稳定值M表明其稳定性更高。

图4是geNorm确定用于准确定量分析最优的内参基因数目；在第n个标准化因子和第n+1个标准化因子之间分析配对差异，星号表明最合适的内参基因数目。

图5是利用筛选到的梨内参基因SKD1和YLS8计算APX基因在两种树形的不同发育时期叶组织中的表达量变化；DP表示棚架树形，SP表示疏散分层形，后面5，6，7，8代表相应的月份，如DP5代表的是棚架树形5月份的梨叶组织样本，其他依次类推。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：筛选两种树形的梨叶组织在不同发育时期中稳定表达的内参基因组合

1.根据发明人实验室获得的转录组分析结果及其他已报道的梨内参基因序列信息，初步筛选表达相对较为稳定13个梨候选内参基因，其基因名分别为：Actin2、ARM、EF1a、GAPC、Histone H3、MYB10、SAND、SKD1、SR34A、TIP41-like、TUB7、UBQ5、YLS8；针对上述候选基因，设计相应扩增引物。

2.提取两种树形(棚架树形和疏散分层形)的梨成年树叶组织在不同发育时期(5月、6月、7月和8月)样品的总RNA。

3.梨叶组织样品的cDNA的合成：

1)冰上准备反应混合液：依次加入1μg总RNA、1μl Oligo(dT)引物，DEPC水补齐至12μl。

2)65℃温浴5min，冰上冷却2min。

3)稍离心；将离心管放在冰上，依次加入4μl 5×Reaction buffer、1μl Ribonuclease inhibitor核糖核酸酶抑制子、2μl 10mM dNTP mix和1μl Revert Aid^TM>

4)轻轻混匀，离心。

5)42℃温浴60min，70℃温浴5min。

每个样品做三次生物学重复。由此制备得到各个样品梨叶组织cDNA。

4.以上述获得的所有样品的cDNA等核酸量混合后作为扩增模板，利用PCR检测引物的特异性，反应体系为25μl 2×SuoerTaq PCR mix，2.5μl 10μM正向引物和反向引物，所有待测样品的混合模板1μl，ddH₂O补齐至50μl。PCR反应循环设置为94℃预变性2min；35个循环(98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸5sec)；72℃延伸10min。利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测13个候选内参基因片段的PCR扩增产物，结果如图1所示。说明候选内参基因的引物的均具有很好的特异性。纯化PCR产物，测序验证所扩增的片段是否为目标序列。

5.以两种树形的梨叶组织在不同发育时期的cDNA为模板，对13个内参基因在qRT-PCR仪器上进行反应。在qRT-PCR仪仪上选择SYBR Green法进行反应。qRT-PCR体系为10μL，包含5μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，10μmol/L的正向引物(F)和反向引物(R)各0.5μL，cDNA模板0.5μL，加ddH₂O至10μL，设置4个技术重复；体系中的cDNA模板均为1μg>

表1候选内参基因、引物序列及扩增产物信息

6.利用qRT-PCR检测所有样本的Ct值，通过geNorm软件计算各基因在不同发育时期表达稳定性平均值(M)，并对内参基因的表达稳定性排序。以0.15为阈值，通过标准化因子配对差异分析(V_n/n+1)值来判定内参基因的最合适数目。结果如图3所示，利用geNorm确定了候选内参基因在两种树形叶发育过程中稳定性由强到弱依次为SKD1/YLS8>Actin2>UBQ5>ARM>HistoneH3>GAPC>SAND>TIP41-like>SR34A>MYB10>EF1a>TUB7。

同时，geNorm用于确定准确定量的最优内参基因数目，在第n个标准化因子和第n+1个标准化因子之间分析配对差异。结果如图4所示，柱形图里左数第一个柱子高度小于0.15，已用星号标出，对应的横坐标是V2/V3，所即n＝2，所以两种树形的梨叶片在不同发育时期中稳定表达的内参基因组合最小数目是2，即最佳的内参基因组合是SKD1和YLS8。其中，内参基因SKD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，内参基因SKD1的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；内参基因YLS8的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，内参基因YLS8的特异性引物的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。

实施例2：对梨APX基因表达量变化进行计算

选择最稳定表达的2个内参基因(SKD1和YLS8)，2个不稳定表达的内参基因(EF1a和MYB10)和2个常用的梨内参基因(TUB和UBQ10)，对目的基因APX在两种树形的梨叶组织不同发育时期中表达量的变化分别进行计算。结果如图5所示，发现利用2个最稳定的内参基因SKD1、YLS8及其组合对基因的定量最准确，而用不稳定表达的内参基因和2个常用的内参基因，目标基因APX的表达在两种树形的叶片发育某个阶段会发生较大偏差。

本发明筛选出两种树形的梨叶组织在不同发育时期中合适的内参基因组合是SKD1和YLS8。与传统单一的内参基因方法相比，检测相关基因的表达水平准确性更高。本研究筛选到的内参基因组合对后续基因表达研究提供了可靠保证。

序列表

<110> 湖北省农业科学院果树茶叶研究所

<120> 两种树形梨不同发育时期叶组织的荧光定量内参基因及其引物和应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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ctcccagggc tgtgtttcct a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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cccaggactt tgagctttat gc 22

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> DNA

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<213> 梨(Pyrus spp.)

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<212> DNA

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taccaactgc cttgctcccc ttgccaaggt tatcaacgac aggtttggga ttgttgaggg 120

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<212> DNA

<213> 梨(Pyrus spp.)

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<212> DNA

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<213> 梨(Pyrus spp.)

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