家蚕常用内参基因的稳定性分析及两种实时荧光定量PCR方法比较

摘要

实时荧光定量PCR技术目前已经成为检测基因转录水平的有效方法，由于其快速灵敏及重复性好等优点使得其应用日趋广泛。在相对定量中一般选取不同的管家基因作为内源参照基因，用来去除不同样本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而校正目的基因特异性表达差异。但是近年来，越来越多的文献报道了内参基因的表达并不稳定，如果没有合适的标准化处理，目的基因的表达将会被误导。
　　 本文应用实时荧光定量PCR技术检测了7种家蚕常用内参基因(ACT3，GAPDH,28SrRArA，RPL3，a-Tubulin，UBC和TBP)的转录表达水平，并利用标准化分析软件geNorm和NormFinder进行稳定性分析，得出正常条件的不同组织中及不同刺激条件下最稳定的内参基因，计算出相对定量中选择合适内参的数目。七种常用内参基因的选择分别来自不同的功能，以避免出现表达水平的共调节。应用双跟踪标定荧光定量技术对内参基因的表达水平进行直观的作图，选择目的基因GSTs1(glutathioneS-transferasesigma1)进行验证，检测GSTs1在脂肪体中的转录水平变化，比较双跟踪标定定量和相对定量的结果数据,进而分析两种方法的不同之处。最后采用GST酶活性变化水平进一步例证。结果发现：
　　 1．候选的内参基因的表达并不稳定，标准化软件分析的结果显示，不同的实验条件下检测出合适内参基因的种类不同，标准化程序geNorm和NormFinder给出的结果也略有不同。考虑一致性得出结果：在正常组织中，ACT3，GAPDH,a-Tubulin在中肠组织，a-Tubulin，UBC，TBP在脂肪体组织，UBC，a-Tubulin，ACT3在马氏管组织中是最合适选择；刺激组中，蜕皮激素处理下a-Tubulin和UBC在三种组织中：芸香苷处理下a-Tubulin和UBC在中肠，马氏管；ACT3和GAPDH在脂肪体中是最合适的选择。合适内参基因的选择要根据具体的实验条件，而不是武断的参考其他物种或者一般常用的内参照选择。
　　 2．选用双跟踪标定技术能够直观的显示内参基因的表达量，通过SPSS17.0统计学分析结果显示，7种候选内参基因在不同发育阶段的描述性统计学分析P值＜0.01，在不同刺激条件下刺激组与对照组之间P值＜0.05，均表现显著差异性，即内参基因的表达水平并不是稳定不变的。
　　 3．通过检测目的基因GSTsl的转录水平，双跟踪定量（双外参法）与相对定量方法测得的结果略有不同。两种方法的原理本质存在差异之处，分析其各自特点，应用双跟踪定量技术更为合理。
　　 4．GST蛋白酶活性检测结果显示，蛋白水平与内参基因的每转录水平拷贝数的相关性更高，从侧面说明应用双跟踪定量技术结果更为准确。
　　 本研究分析指出，家蚕作为模式生物，由于其特殊的生理周期变化，相对定量技术中内参基因的选择不能盲目参照其他物种；公认应用频率最高的内参基因ACT3也并不是最稳定的参照基因，在测定目的基因之前，需要对内参基因进行整体的评估。从原理和实际操作上来讲，应用双跟踪标定技术能得到更加准确的结果。本研究一方面为家蚕内参基因的选择提供了参考，保证相对定量中目的基因的检测结果可靠准确；另一方面通过对双跟踪定量方法的应用介绍，也在一定程度上推动实时荧光定量PCR技术的进一步发展创新。