机械性创伤诱发小鼠心肌细胞凋亡机制的研究

摘要

研究背景：
　　机械性创伤（Mechanicaltrauma,MT,如车祸引起的创伤性伤害）在世界上是一个重要的医疗和社会问题。众所周知，胸部MT可以直接引起心脏损伤（如心脏挫伤和血管撕裂）。然而，几个临床小组报道，即使没有直接的机械性心血管损害，钝性胸部MT也可以引起心肌梗死及心脏功能减退。这些结果强烈提示,MT除了即刻对心脏的直接损伤外，还可以引起一种继发性心脏伤害，其机制尚不清楚。
　　越来越多的证据表明，心肌细胞的凋亡可以导致心脏功能不全。MT后即刻给予非选择性半胱天冬蛋白酶（Caspase）抑制剂，不仅可以阻断MT引起的心肌细胞凋亡，而且可以减轻MT后的心脏功能不全。这些结果表明MT引起心肌细胞凋亡，继之可引起MT后的心脏功能不全。然而，MT导致MT后心肌细胞凋亡的病理性介质的来源和作用机制仍不清楚。辨明MT后心脏功能不全的发病机制，寻找阻止MT后继发性心脏损害的治疗策略，对于减少所有MT相关的器官损害至关重要。
　　研究目的：
　　1、确定MT引起心肌细胞凋亡的病理性介质的来源，源于创伤性心肌细胞（TCs）还是创伤性血浆（TP）；
　　2、找出MT引起心肌细胞凋亡的主要病理性介质；
　　3、阐明MT通过病理性介质触发心肌细胞凋亡的细胞内信号通路，以期搞清病理性介质、细胞凋亡与氧化/硝化应激的关系。
　　研究方法：
　　1、制备小鼠非致命性机械性MT模型。麻醉小鼠后，将其置于Noble-Collip鼓（直径12英寸），以40rpm的转速，旋转200圈，造成小鼠非致命性MT伤害。
　　2、为了确定MT后引起心肌细胞凋亡的病理性介质来源于TCs还是TP，分别分离MT组小鼠心肌细胞（TCs）和对照组小鼠心肌细胞（NCs），并分别用含有10％的TP(从MT后1.5h不同小鼠得到）或正常小鼠血浆（NP）的培养液培养12h。
　　3、为了辨明MT后触发心肌细胞凋亡的病理性介质,分离MT小鼠心肌细胞，并分别与下列因子一起培养12h：1)NP;2)TP;3)干扰素(IFN-)、白细胞介素1（IL-1）和肿瘤坏死因子α（TNF-）的混合物;4)分别填加细胞因子混合物中的单一成分；5)TP和抗TNF-抗体;6)TNF-基因敲除鼠的TP。
　　4、为了阐明氧化/硝化应激在MT触发的心肌细胞凋亡中的作用，分离MT小鼠心肌细胞，分别给予下列之一处理并培养细胞12h：1)NP;2)TP;3)TP和1400W（一种高度选择性iNOS抑制剂）;4)TP和apocynin（一种NADPH氧化酶抑制剂）;或5)TP和FP15（一种ONOO-分解催化剂）。
　　5、给予野生型小鼠MT处理后，在体分别给予溶剂、etanercept(一种TNF-拮抗剂)、1400W、apocynin和FP15;给予TNF-基因敲除（TNFα-/-）鼠MT处理，不做任何其他处理。将小鼠于MT12h后处死。
　　6、使用相应酶联免疫吸附法（ELISA）分析试剂盒测定血浆IFN-、IL-1和TNF-浓度。
　　7、通过检测caspase-3活性、ELISA法测定核小体或末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记术（TUNEL）染色确定心肌细胞的凋亡情况。
　　8、使用光泽精加强发光法检测心肌。O2-的产生量。
　　9、使用ELISA法检测心肌细胞硝基酪氨酸（一种在体ONOO-印迹）的含量。
　　10、使用蛋白质印迹（Westernblot）法检测心肌gp91phox（NADPH氧化酶的一种主要成分）和iNOS含量。
　　11、使用化学发光NO探测仪检测NOX（NO及其代谢产物NO2和NO3的统称）含量。
　　研究结果：
　　1、将TP加到TCs培养液中，引起caspase-3活性的升高（NC+NP组的2.18±0.24倍,P<0.01,n=9）。而将TCs与NP一起培养，未观察到caspase-3活性显著性改变（NC+NP组的1.13±0.09倍,P>0.05,n=10）。然而，将TP加到NCs培养液中，观察到caspase-3活性的升高（NC+NP组的1.88±0.18倍,P<0.01,n=9）。这一结果证实，MT引起心肌细胞凋亡的病理性介质存在于TP，而非TCs自身及NP中。
　　2、虽然MT后，血浆中不同的细胞因子表现出不同的时间曲线的变化，但与对照组比较，创伤动物IL-1、IFN-、和TNF-的血浆水平均显著性升高（2.19±0.16vs.1.11±0.02pg/mg蛋白,1.22±0.14vs.0.68±0.02pg/mg蛋白,0.48±0.02vs.0.19±0.01pg/mg蛋白,P<0.01,n=7-9）。值得注意的是，所有这三个细胞因子达到高峰的时间均早于文献所述的MT后心肌细胞凋亡发生的时间点，即在或早于MT后1.5h。
　　3、将NP和细胞因子混合物与TCs一起培养，导致caspase-3活性的升高（NP组的1.71±0.18倍,P<0.01,n=9），升高程度与使用TP处理心肌细胞所观察到的相似，提示这些细胞因子在TP引起的心肌细胞凋亡中发挥作用。
　　4、与NP组比较，单独填加IFN-或IL-1，对caspase-3活性无明显影响（NP组的0.88±0.15和1.11±0.12倍,P>0.05,n=7-9）。然而，以细胞因子混合物中的使用浓度，单独填加TNF-显著性增加了caspase-3活性（NP组的1.64±0.14倍,P<0.01,n=9），提示TNF-是细胞因子混合物中引起心肌细胞凋亡的细胞因子。
　　5、使用抗TNF-抗体中和TNF-，几乎完全阻断了TP引起的心肌细胞caspase-3的激活(1.13±0.17vs.1.88±0.18NP组的倍数，P<0.01,n=7)。与野生型小鼠TP比较，填加TNF--/-小鼠的TP不能引起显著性caspase-3的激活（1.10±0.19vs.1.88±0.18NP组的倍数，P<0.01,n=9）。这些结果证明存在于TP中的TNF-是TP引起心肌细胞凋亡首要因素。
　　6、与NP组比较，使用TP处理心肌细胞，iNOS和gp91phox蛋白表达显著性上调(NP组的2.44±0.42倍和NP组的1.63±0.18倍，P<0.01,n=7-9)，NO和。O2-产生显著性增多(NP组的2.37±0.31倍和NP组的1.54±0.17倍，P<0.01,n=7-9)，ONOO-的产生也显著性增加(8.02±1.23vs.1.87±0.25nmol/g蛋白,P<0.01,n=7-9)。
　　更重要的是，使用抗TNF-抗体中和TNF-几乎完全阻断了TP引起的氧化/硝化应激，与溶剂组相比，iNOS和gp91phox蛋白的显著性表达被抑制(1.34±0.32vs.2.44±0.42NP组的倍数,1.15±0.10vs.1.63±0.18NP组的倍数，P<0.01,n=7-9)，NO和。O2-产生明显减少(1.32±0.12vs.2.37±0.30NP组的倍数,1.11±0.09vs.1.54±0.17NP组的倍数，P<0.01,n=7-9)，ONOO-的产生也显著性减少(2.77±0.72vs.8.02±1.23nmol/g蛋白，P<0.01,n=7-9)。这些结果提供了明确的证据，即存在于TP中的TNF-是引起TCs显著氧化/硝化应激的首要因素。
　　7、与TP组比较，使用1400W显著性减少了置于TP的心肌细胞的NO产生量（1.04±0.13vs2.26±0.11NP组的倍数,P<0.01,n=10），而未影响。O2-的产生量（1.42±0.07vs.1.62±0.15NP组的倍数,P>0.05,n=10）。相反，使用apocynin显著性减少了。O2-的产生量（1.04±0.05vs.1.62±0.15NP组的倍数,P<0.01,n=10），而未影响NO的产生量（2.20±0.19vs.2.26±0.11NP组的倍数,P>0.05,n=10）。使用FP15既未影响NO（2.16±0.18vs.2.26±0.11NP组的倍数,P>0.05,n=9），也未影响。O2-的产生量（1.40±0.06vs.1.62±0.15NP组的倍数,P>0.05,n=9）。然而，所有三种处理均显著性减少了ONOO-的产生量（2.61±0.35,3.06±0.55,1.55±0.33vs.8.09±1.28nmol/g蛋白,P<0.01,n=11），并且减少了TP引起的caspase-3激活（1.24±0.16,1.05±0.10,1.01±0.14vs.1.91±0.14NP组的倍数,P<0.01,n=10）。这些结果表明TNF-触发的氧化/硝基化应激在TP引起的心肌细胞凋亡中发挥着极重要的作用。
　　8、在体实验，与对照组比较，MT导致野生型小鼠显著性心肌细胞凋亡，表现为TUNEL阳性细胞增多（8.37±0.57vs.0.32±0.09％，P<0.01,n=10）和caspase-3活性升高（是对照组2.9±0.2倍，P<0.01,n=10）。使用etanercept明显减少了MT后心肌细胞TUNEL阳性染色率（1.2±0.14％vs.8.37±0.57％,P<0.01，n=10）和降低caspase-3活性（1.5±0.45vs.2.9±0.2对照组的倍数,P<0.01,n=10）。给人留下深刻印象的是，与野生型MT小鼠比较，在TNF-α基因敲除MT小鼠，几乎无TUNEL阳性细胞（0.8±0.19％vs.8.37±0.57％,P<0.01,n=10）和caspase-3激活（1.4±0.16vs.2.9±0.2对照组的倍数，P<0.01,n=10）。
　　9、与对照组比较，野生型小鼠MT处理后，iNOS(29,610±5,093vs.1,938±717AU,P<0.01，n=10)和gp91phox(104,317±4,361vs.10,619±1,522AU,P<0.01，n=10)的蛋白表达上调，NO(9.9±0.7vs.7.1±0.4μmol/g蛋白,P<0.01，n=10)和。O2-（273±13.9vs.153±8.3RLU/mg组织,P<0.01,n=10）产生增加，并且蛋白质硝基化明显增加（2.86±0.09vs.1.67±0.05nmol/g蛋白,P<0.01,n=10）。
　　然而，与溶剂组比较，在体使用etanercept或TNF-基因敲除处理，降低iNOS蛋白表达（3,380±1,053，2,512±1,154vs.29,610±5,093AU,P<0.01,n=10）和NO的产生量（7.04±0.56，7.44±0.32vs.9.9±0.7μmol/g蛋白,P<0.01,n=10），减少gp91phox蛋白表达（26,478±4,361,6861±2,239vs.104,317±4,361AU,P<0.01,n=10）和。O2-的产生（163.1±12.70,146.1±22.18vs.273.2±14.93RLU/mg组织,P<0.01,n=10），并且减少了蛋白质硝基化（2.09±0.12,1.54±0.19vs.2.86±0.08nmol/g蛋白,P<0.01,n=10）。
　　10、在体实验，与溶剂组比较，使用1400W/apocynin阻断iNOS/NADPH氧化酶的活性，或使用FP15增加ONOO-的分解，明显地减少了TUNEL染色数（2.50±0.49、1.51±0.28和1.62±0.12％vs.8.23±0.48％P<0.01,n=9－11）和caspase-3的激活（1.63±0.14、1.29±0.09和1.05±0.10vs.2.05±0.15空白对照组的倍数,P<0.05或P<0.

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缩略语表

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英文摘要

前言

文献回顾

1. 创伤

2．细胞因子

3．细胞凋亡

4．活性氮

5．蛋白质硝基化及其在细胞凋亡中的潜在作用

正文

引 言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历

致谢