miR-34重建对p53缺陷肿瘤生长及耐药性的影响

摘要

【背景】
　　复发肿瘤的抗治疗效应是临床肿瘤治疗目前遇到的最大难题之一，即肿瘤在初次有效治疗之后往往复发和转移并且对放化疗不再敏感，呈现恶性转归。最新研究认为抗治疗效应是由于肿瘤内部存在肿瘤干细胞（Cancerstemcells）所致。肿瘤干细胞是指肿瘤细胞群中含有少数具有自我更新(Self-renewal)能力和无限增殖潜能，能够导致肿瘤形成和生长的细胞。肿瘤干细胞对化疗更易耐药，对放疗不敏感，抵抗治疗而存活，是导致肿瘤复发和转移的根本原因。研究针对肿瘤干细胞的靶向治疗将有助于开拓肿瘤治疗的新思路，为从根本上治愈肿瘤提供可能。
　　最新研究表明miRNA（microRNA）能够参与细胞自我更新和分化过程。miRNA是一群长度为20-22nt的内源性非编码小RNA，能够通过与靶基因mRNA特异性的碱基配对引起mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因表达进行调控。目前已经证实miRNA可在肿瘤发生过程中调节细胞增殖和凋亡的过程，有些miRNA分子还可作为原癌基因或抑癌基因调控肿瘤。
　　LNCaP和CL1是美国加州大学洛杉矶分校Belldegrum教授建立的用于研究抗治疗效应的细胞模型。CL1细胞与其对照的LNCaP细胞相比，恶性程度增加，肿瘤侵袭性和转移性增强，对药物治疗和放射治疗不再敏感。应用LNCaP及衍生的CL1这一对细胞模型，研究抗治疗效应所涉及的作用机制将有助于更好地理解肿瘤发生发展转归的病理过程。
　　我们的研究发现miR-34不仅能够参与p53调控肿瘤的网络通路，而且能够在p53功能缺陷的胰腺癌、胃癌和前列腺癌细胞中重建抗肿瘤效应，调节肿瘤细胞的自我更新能力，提示miR-34可能作为一个抑癌基因参与肿瘤的病理生理进程，并且涉及到其中肿瘤干细胞的生长发育。
　　【目的】
　　探讨miR-34重建对p53功能缺陷肿瘤细胞生长及耐药性的影响机制。
　　【方法】
　　1．抗治疗效应细胞株CL1及其对照细胞LNCaPmiRNA芯片检测
　　用miRNA分离试剂盒提取两种细胞的总RNA，检测RNA浓度和纯度，送美国LCSciences公司microRNA微阵列芯片检测，分别用Cy3和Cy5标记两种细胞样品，在标准条件下使用热收缩杂交袋将标记好的样品与MRA-1001芯片杂交，采用芯片扫描仪扫描芯片荧光强度，并将其转换为数字型数据保存，使用专业配套软件比较2个样本的荧光强度差异，分析记录结果。
　　2．miR-34的转染及其靶基因表达的检测
　　合成miR-34a，miR-34b，miR-34c及阴性对照miRNA，转染肿瘤细胞；合成miR-34的抑制型mimic及阴性对照miRNA，转染入miR-34高表达的肿瘤细胞；Westernblot检测潜在靶基因蛋白表达情况；Real-timePCR检测潜在靶基因mRNA表达情况；构建包含Bcl2-3'UTR的报告基因载体或与miRNA结合位点的突变体，与miRNAmimic共转染，检测报告基因活性。
　　3．miR-34高表达病毒感染肿瘤细胞及其稳定株的筛选鉴定
　　将表达miR34a的慢病毒载体及对照载体分别与慢病毒包装系统共同转染293病毒包装细胞，收集上清过滤后感染肿瘤细胞，经抗生素筛选获得稳定株。用Westernblot，Real-timePCR和报告基因实验鉴定稳定细胞株。
　　4．miR-34的抗肿瘤效应
　　对瞬时转染miR-34的肿瘤细胞和稳定表达miR-34的肿瘤细胞，检测细胞生长曲线；克隆形成实验检测单个肿瘤细胞集落生长能力；流式细胞术检测细胞周期变化；SubG1和Caspase3功能活性实验检测细胞凋亡；Transwell小室实验检测细胞侵袭能力；MTT实验检测细胞对化疗药物的敏感性；给予放射线照射和药物诱导检测细胞凋亡情况。
　　5．miR-34对肿瘤细胞自我更新能力的调控
　　Tumorsphere形成实验检测miR-34对肿瘤细胞自我更新能力的影响。以CD44+/CD133+荧光标记抗体双染肿瘤细胞后用流式细胞仪进行分选，收集各组分细胞，观察Tumorsphere形成，提取RNA用Real-timePCR检测基因表达情况。
　　6．miR-34对肿瘤细胞裸鼠成瘤能力的影响
　　收集瞬时转染miR-34的肿瘤细胞和稳定表达miR-34的肿瘤细胞，皮下种植裸鼠腹部，定期测量动物体重和肿瘤大小，实验结束时测量肿瘤重量，观察肿瘤细胞成瘤性。
　　【结果】
　　1．miRNA芯片检测
　　p53野生型的LNCaP细胞经过抗治疗效应诱导得到的CL1细胞中出现p53缺失，对放化疗敏感性显著降低，肿瘤恶性程度增加。microRNA微阵列芯片检测发现miR-34a在CL1细胞系表达显著低于LNCaP。
　　2．miR-34抑制Bcl2，Notch1和Notch2的表达
　　Westernblot发现miR-34转染入p53缺陷的多种肿瘤细胞后可抑制Bcl2，Notch1和Notch2蛋白的表达；Real-timePCR发现miR-34可以不同程度的抑制Bcl2，Notch1和Notch2mRNA的表达；报告基因实验证实Bcl2是miR-34的直接作用靶基因。
　　3．miR-34高表达病毒感染肿瘤细胞及其稳定株的建立
　　扩增慢病毒穿梭载体p-miR34a-MIF及其对照载体p-MIF，分别与慢病毒包装系统骨架质粒pFIV-34N和pVSV-G共同转染293病毒包装细胞，48小时后收集上清慢病毒miR34a-MIF-virus及其对照病毒MIF-virus，过滤后加入辅助感染试剂polybreen感染肿瘤细胞，经抗生素Zeocin筛选2-3周后获得稳定株；Westernblot发现miR-34稳定表达株中Bcl2表达下调；Real-timePCR检测发现miR-34稳定表达株中靶基因mRNA表达下调；报告基因实验证实其表达的miR34a能够抑制Bcl2-3'UTR报告基因活性。
　　4．miR-34抑制肿瘤细胞生长和侵袭能力，增强放化疗敏感性
　　表达miR-34的肿瘤细胞生长明显减慢；克隆形成实验发现表达miR-34的肿瘤细胞集落生长能力降低，而转染miR-34抑制型mimic的肿瘤细胞集落生长能力增加；流式细胞术检测发现miR-34改变细胞周期，引起细胞周期G1阻滞；Caspase3功能活性实验发现miR-34能够促进细胞凋亡；Transwell小室实验发现miR-34能够抑制肿瘤细胞侵袭能力；MTT实验发现miR-34能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；miR-34能够促进肿瘤细胞因放射线照射和化学药物诱导的细胞凋亡。
　　5．miR-34抑制肿瘤细胞自我更新能力
　　Tumorsphere形成实验发现miR-34可以抑制肿瘤细胞自我更新能力。以CD44+/CD133+荧光标记抗体双染肿瘤细胞，用流式细胞仪进行分选并收集各部分细胞。Tumorsphere形成实验发现双阳性细胞形成Tumorsphere能力显著高于单阳性细胞，而双阴性细胞不形成Tumorsphere。Real-timePCR检测发现双阳性细胞中miR-34前体和成熟体转录本表达降低。
　　6．miR-34抑制肿瘤细胞裸鼠成瘤
　　裸鼠成瘤实验发现表达miR-34a的肿瘤细胞肿瘤生长较之对照细胞肿瘤体积变小和重量减轻，生长明显减慢。
　　【结论】
　　1．miR-34在恶性程度增加的细胞系表达显著降低，提示miR-34可能作为一个抑癌基因参与肿瘤进程。
　　2．miR-34可以抑制p53功能缺陷的胰腺癌、胃癌和前列腺癌细胞的生长和侵袭能力，引起细胞周期改变，G1阻滞和促进肿瘤细胞凋亡。
　　3．miR-34可以协同化疗药物和放射线促进细胞凋亡，提高肿瘤对化疗药物和放射治疗的敏感性。这一发现有助于探索对相关肿瘤的治疗措施。
　　4．miR-34可以在体外抑制肿瘤细胞Tumorsphere形成，在裸鼠体内减慢肿瘤细胞成瘤能力。提示miR-34在体内外均具有抗肿瘤效应。
　　5．miR-34的下游靶基因Bcl2,Notch1和Notch2是调控肿瘤干细胞的重要因子，进而提示miR-34可能是通过靶向肿瘤干细胞而抑制肿瘤细胞的增殖和自我更新。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一 miRNA与肿瘤的发生，发展和预后相关

二 肿瘤干细胞的简要概述

三 miRNA 与肿瘤干细胞调控的关系

第一部分 miRNA 芯片检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 miR-34 抑制Bcl2 和Notch基因表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 miR-34 病毒感染及稳定细胞株的筛选鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 miR-34 的抗肿瘤效应

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五部分 miR-34 对肿瘤细胞自我更新能力的调控

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第六部分 miR-34 对肿瘤细胞裸鼠成瘤能力的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

后 记

参考文献

个人简历和研究成果

致谢