人脐带间充质干细胞分泌的微囊通过ATM-p53途径抑制膀胱肿瘤生长的研究

摘要

目的:
　　膀胱癌是泌尿系中最常见的恶性肿瘤之一，多以移行细胞癌为主，临床上分为非肌层浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌，其中浸润性膀胱癌恶性程度较高、易转移，如治疗不及时，预后较差。之前的研究表明，来源于脐带间充质干细胞(human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells,hWJMSCs)的微囊(microvesicles，MVs)可以有效的降低膀胱肿瘤细胞的浸润性并诱导肿瘤细胞凋亡。在其作用过程中，hWJMSC-MVs首先上调p53蛋白的表达量，随后激活的p53基因通过调控一系列下游靶点基因（p21、Caspase3）来抑制膀胱肿瘤细胞的增殖。然而该信号通路的上游调控因子ATM(Ataxia telangiectasia mutatedkinase)的作用尚未明确。有研究表明，ATM低表达的肿瘤细胞接受射线、化学药物等处理更容易被诱导凋亡。因此，我们假设ATM的基础表达水平可以影响hWJMSC-MVs对膀胱肿瘤细胞的作用效果。本项目中，我们首先验证hWJMSC-MVs是否能对膀胱肿瘤的增殖产生抑制效果和ATM在hWJMSC-MVs作用中的表达情况，再通过ATM特异性抑制剂和激活剂改变ATM蛋白的表达水平，最后分析hWJMSC-MVs处理膀胱肿瘤细胞后肿瘤细胞周期停滞与凋亡指数的变化及ATM-p53-p21通路中主要靶点蛋白的活化、表达水平的改变。以此来探讨ATM对人脐带间充质干细胞微囊抑制膀胱肿瘤细胞生长的可能调控机制。这为将来临床上微囊治疗肿瘤奠定良好的实验基础。
　　方法:
　　1.采用MTT比色法检测不同浓度hWJMSC-MVs对不同的膀胱肿瘤细胞系的生长抑制。
　　2.采用流式细胞仪技术来分析膀胱肿瘤细胞的细胞周期以及细胞凋亡量。
　　3.在不同的作用条件下，采用Western blot来分析ATM，p-ATM，p53，p21，Bax和cleaved Caspase3蛋白的表达水平。
　　结果:
　　1.在相同作用时间的条件下，随着hWJMSC-MVs浓度的增加，三种膀胱肿瘤细胞系的凋亡量也明显增加。其中T24细胞系最为敏感。
　　2.hWJMSC-MVs可以通过激活ATM-p53信号通路导致G0/G1期的细胞周期阻滞。
　　3.hWJMSC-MVs通过提高cleaved caspase3和Bax凋亡蛋白的表达来引起T24细胞的凋亡。
　　4.在hWJMSC-MVs的作用情况下，通过抑制ATM-p53信号通路来废除T24细胞G0/G1期的周期阻滞，进一步提高了hWJMSC-MVs对肿瘤细胞的凋亡作用。
　　结论:
　　通过本实验可以看出，在hWJMSC-MVs使用剂量增加的情况下，其对T24细胞的G0/G1期阻滞效果和诱导凋亡的效果也明显加强。本研究首次证明在hWJMSC-MVs作用下ATM-p53信号通路被激活，hWJMSC-MVs诱导上调了p-ATM、 p53、p21、cleaved caspase3和Bax蛋白水平从而对细胞周期及凋亡产生了影响。通过目前的研究，我们进一步的了解了有关膀胱肿瘤细胞G0/G1阻滞和细胞凋亡之间的相互作用关系，并证明了激活的ATM-p53信号通路对膀胱肿瘤细胞的存活是起到保护作用的。明确阐述了G0/G1期的细胞阻滞在膀胱癌的治疗过程中的潜在作用。我们的研究结果可以更好理解并处理这一复杂的治疗环境，在该治疗情况下，我们可以把hWJMSC-MVs正确与其他化疗药物组合，这样就使癌细胞应对hWJMSC-MVs作用时出现更有效的癌细胞特异性死亡。相信在不久的将来，来源于充质干细胞的微囊，可以变成一种新的抗癌药物来应用于临床。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1 膀胱肿瘤细胞系

1．2 脐带标本

1．3 细胞培养试剂

1．4 主要实验仪器

2．试验方法

2．1 hWJMSCs的原代培养

2．2 膀胱肿瘤细胞培养

2．3 细胞传代

2．4 hWJMSC-MVs制备

2．5 hWJMSC-MVs透视电镜检测

2．6 膀胱肿瘤细胞增殖活力检测(MTT法)

2．7 膀胱肿瘤细胞周期检测

2．8 膀胱肿瘤细胞凋亡检测

2．9 Western blotting

2．10 统计学方法

结果

1．hWJMSC-MVs分离及鉴定

2．hWJMSC-MVs明显抑制膀胱肿瘤T24细胞增殖

3．hWJMSC-MVs激活ATM-p53通路诱导T24细胞G0／G1期阻滞并通过上调Cleaved Caspase3，Bax蛋白表达量引起膀胱肿瘤细胞凋亡

4．抑制ATM-p53信号通路的表达，可以提高hWJMSC-MVs对T24细胞的凋亡作用

讨论

结论

参考文献

综述 间充质干细胞分泌微囊的潜在治疗作用的研究进展

临床病例报告

致谢