毛栓孔菌菌丝体培养特性及其体外抗肿瘤活性的研究

摘要

对野生分离的多孔菌属菌株采用改进的CTAB法进行DNA的提取分离，通过PCR扩增，电泳检测并将所得结果通过ITS测序;通过在Genbank中进行比对和同源性分析，发现该菌株与毛栓孔菌（Trametes hirsuta）属的同源性相似度极高，据此判断该野生菌株为毛栓孔菌（Trametes hirsuta）。 采用固体平板培养对毛栓孔菌菌丝体生长的营养条件和环境条件进行研究，通过单因素筛选试验，确定菌丝体生长的最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是酵母粉，最佳碳氮比是90∶1，对菌丝体生长最佳的无机盐是K2HPO4和Na2SO4;21金维他对其菌丝体生长促进作用明显，最适pH为11，菌丝体生长的最适温度是34℃;黄光(160Lx)对其菌丝体生长的影响明显。通过正交试验确定毛栓孔菌菌丝体生长的最佳营养条件是蔗糖4％，酵母粉1.3％, K,HPO40.05％, Na,SO40.2％。 通过对毛栓孔菌菌株液体培养的营养条件和环境条件进行研究，结果表明:毛栓孔菌液体培养的最佳碳源是乳糖，最佳氮源是硝酸钠，最佳的碳氮比是50∶1，VB12对其液体培养影响明显，最佳无机盐是KH2PO4和MgSO4·7H2O。从经济适用角度考虑采用正交试验确定毛栓孔菌液体发酵多糖产量的最佳条件是:C6H12O64％，（NH4）2SO41％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O0.03％。通过对装液量、接种量、pH的研究表明，在pH4、装液量200mL，接种量5mL的条件下，毛栓孔菌液体发酵多糖产量最好。 用水浸提法，通过对提取温度、提取时间、料液比、提取次数的研究确定用量分别是80℃、2.5h、1∶30、2次;对温度、时间、料液比进行正交试验，确定最佳条件是80℃、2.5h、1∶40。 毛栓孔菌发酵液提取多糖体外抗肿瘤试验结果表明:对乳腺癌MDA细胞株试验中，阳性对照对乳腺癌MDA细胞的抑制作用最高，抑制率是62.21％，中浓度的醇溶性多糖对MDA乳腺癌细胞的抑制作用明显好于高和低浓度，为42.01％;而水溶性多糖对MDA乳腺癌细胞的抑制作用都明显的低于阳性对照。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 食药用真菌多糖的研究历史

1．2 食药用真菌的研究意义

1．3 食药用菌液体发酵

1．4 食药用真菌多糖的结构与构象

1．5 真菌多糖的构象研究

1．6 食药用真菌多糖的制备与纯化

1．6．1 真菌多糖的提取

1．6．2 真菌多糖的分离纯化

1．6．3 真菌多糖的鉴定

1．7 多糖药理活性的研究

1．7．1 抗肿瘤

1．7．2 免疫调节作用

1．7．3 抗衰老

1．7．4 降血糖

1．7．5 抗病毒作用

1．7．6 保肝健胃作用

1．8 毛栓孔菌简介

1．9 本项目研究目的与意义

2 毛栓孔菌菌株的鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 供试菌株

2．1．2 主要试剂及溶液

2．1．3 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 菌种活化

2．2．2 DNA提取

2．2．3 DNA浓度及纯度的测定

2．2．4 PCR扩增反应

2．2．5 基因测序

2．3 结果与分析

2．4 讨论

3 毛栓孔菌菌丝体培养性状的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 供试菌株

3．1．2 供试培养基

3．2 试验方法

3．2．1 不同的碳源对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．2．2 不同的氮源对毛栓菌菌丝体生长的影响

3．2．3 不同的碳氮比对毛栓菌菌丝体生长的影响

3．2．4 不同的无机盐对毛栓菌菌丝体生长的影响

3．2．5 不同的生长因子对毛栓菌菌丝体生长的影响

3．2．6 不同的pH对毛栓菌菌丝体生长的影响

3．2．7 不同的温度对毛栓菌菌丝体生长的影响

3．2．8 不同的光照对毛栓菌菌丝体生长的影响

3．2．9 正交试验筛选培养基

3．3 结果与分析

3．3．1 不同的碳源对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．3．2 不同的氮源对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．3．3 不同的碳氮比对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．3．4 不同的无机盐对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．3．5 不同的生长因子对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．3．6 不同的pH对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．3．7 不同的温度对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．3．8 不同的光质对毛栓孔菌菌丝体生长的影响

3．3．9 正交试验结果

3．4 讨论

4 毛栓孔菌液体发酵营养条件的研究

4．1 材料与方法

4．1．1 菌种

4．1．2 培养基配方

4．1．3 主要仪器

4．1．4．技术路线

4．2 试验方法

4．2．1 不同的碳源对菌丝体发酵的影响

4．2．2 不同的氮源对菌丝体发酵的影响

4．2．3 不同的碳氮比对菌丝体发酵的影响

4．2．4 不同的无机盐对菌丝体发酵的影响

4．2．5 不同的生长因子对菌丝体发酵的影响

4．2．6 正交试验设计

4．2．7 菌丝体干重和多糖含量的测定

4．3 结果与分析

4．3．1 多糖标准曲线

4．3．2 不同的碳源对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

4．3．3 不同的氮源对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

4．3．4 不同的碳氮比对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

4．3．5 不同的无机盐对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

4．3．6 不同的生长因子对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

4．3．7 正交试验结果

4．4 讨论

5 毛栓孔菌液体发酵环境条件的研究

5．1 材料与方法

5．2 试验方法

5．2．1 装液量对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

5．2．2 接种量对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

5．2．3 不同的pH对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

5．2．4 正交试验筛选毛栓孔菌液体发酵的最佳环境条件

5．3 结果与分析

5．3．1 装液量对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

5．3．2 不同的接种量对菌丝体发酵的影响

5．3．3 不同的起始pH对毛栓孔菌菌丝体发酵的影响

5．3．4 正交试验结果

5．4 讨论

6 毛栓孔菌菌丝体多糖的提取

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 试剂和药品

6．2 试验方法

6．2．1 菌丝体处理

6．2．2 单因素筛选试验

6．2．3 正交试验筛选最佳条件

6．3 结果与分析

6．3．1 提取温度对毛栓孔菌菌丝体多糖提取的影响

6．3．2 提取时间对毛栓孔菌菌丝体多糖提取的影响

6．3．3 料液比对毛栓孔菌菌丝体多糖提取的影响

6．3．4 提取次数对毛栓孔菌菌丝体多糖提取的影响

6．4 讨论

7 毛栓孔菌发酵液粗多糖体外抗肿瘤试验

7．1 供试材料

7．2 试验方法

7．2．1 试剂的配制

7．2．2 细胞培养

7．2．3 MTT法细胞增殖试验

7．3 结果与分析

7．3．1 毛栓孔菌发酵提取液醇溶性粗多糖体外抑制MDA乳腺癌细胞作用

7．3．2 毛栓孔菌发酵提取液水溶性粗多糖体外抑制MDA乳腺癌细胞作用

7．4 讨论

8 结论

参考文献

附录

致谢

作者简历