重组腺病毒介导IL-18和AFP基因修饰的树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究

摘要

原发性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一，具有复发率高，预后较差的特点，严重威胁着人类的健康。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展，但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想，因此，有必要寻求一种更为有效的治疗手段。围绕着树突状细胞建立的特异性肿瘤免疫治疗方法，为免疫治疗原发性肝癌提供了新方法。
　　甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)主要见于肝癌和生殖细胞来源的肿瘤，是一种胚胎抗原，在70％-80％的原发性肝癌中有较高的表达水平，因此，是HCC免疫治疗的一个良好的靶分子。在以往的研究中证实AFP能够作为一种潜在的诱导特异性的CTL反应的肿瘤抗原用于AFP分泌性肝癌的靶向性免疫治疗。但是以AFP作为靶点均存在诱导免疫效应弱的缺点。而利用转基因技术将某些细胞因子基因导入DC（例如IL-18），具有增强原先较低的肿瘤细胞的免疫原性，提高宿主对肿瘤抗原识别能力以及增强DC的肿瘤抗原递呈的功能，从而达到诱导更强的抗肿瘤免疫效应的目的。因此，在本研究中，我们在以AFP基因为靶点的基础上，联合IL-18基因，通过腺病毒介导Ad-AFP和Ad-IL-18共感染DC，探讨其能否增强DC免疫刺激功能、提高AFP特异性CTL免疫效应的可行性。
　　第一部分：人IL-18、AFP基因腺病毒表达载体的构建及鉴定
　　目的;构建能高效转导AFP、IL-18基因的重组腺病毒，进行病毒扩增和滴度测定，并检测AFP、IL-18抗原表达，以用于DC基因治疗的实验研究。
　　方法:应用AdEasy?腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、IL-18的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle-CMV形成穿梭载体，然后转染到高效的原核细胞一大肠杆菌BJ5183(内含腺病毒骨架质粒pAd-Easy)中，并在该菌内进行同源重组，产生包含目的基因的重组腺病毒基因组质粒，转染293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后，进一步对重组腺病毒分别感染293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。
　　结果:经酶切、PCR鉴定证实，穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为IL-18、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性，可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-IL-182.65×109PFU/ml；Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为4.01×109PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中，表明腺病毒介导的IL-18、AFP基因感染的有效性。
　　结论:成功构建了复制缺陷型AFP、IL-18重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP；重组腺病毒Ad-IL-18、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。
　　第二部分：肝癌患者外周血PBMC来源的树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定
　　目的:以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞（Mononuclearcell，MNC）为来源，建立体外诱导培养DC的方法；以健康供者MNC为对照，检测肝癌DC的形态、表型及功能；利用Ad-GFP作为研究对象，测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。
　　方法:选择肝癌患者及正常人外周血，血细胞分离机分离富集外周血MNC，经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后，加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO15培养液联合诱导DC分化，诱导d6加入TNF-α促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化，FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象，测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率，MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC，按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中，FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。
　　结果:肝癌患者DC鉴定：诱导后，患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8(加TNF-α活化48h)，CD1aCD11cCD86CD80、HLA-DR各抗原表达量明显升高，为典型DC表型；健康对照DC各抗原表达量比较，二者间无显著性差异(P>0.05)。混合淋巴细胞反应结果显示，患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，其刺激指数(SI)与健康对照DC的SI无显著差异(P>0.05)。用Ad-GFP感染培养的DCs时，有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率(multiplicityofinfection,MOI)为200时，感染24小时大于70％的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。并且DC经腺病毒感染DC24小时后，FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。
　　结论:以肝癌患者经动员富集的外周血MNC为来源，联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α，在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可在人外周血MNC来源的DC中高效表达。
　　第三部分：重组腺病毒介导IL-18和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究
　　目的:以腺病毒载体介导AFP基因与IL-18基因修饰树突状细胞，使之即表达肝癌相关抗原AFP，又表达细胞因子IL-18，从而诱导更强的AFP特异性CTLs，探讨AFP、IL－18基因修饰树突状细胞较以往AFP基因修饰DC瘤苗作为肝癌免疫治疗瘤苗是否更具优势。
　　方法:分别以Ad-IL－18、Ad-AFP以及Ad-IL-18和Ad-AFP转染DC，以westernblot及ELISA法检测三组细胞基因表达，以FCM检测感染后DC表型变化。以感染Ad-IL-18、感染Ad-AFP、共感染Ad-IL-18/Ad-AFP的DC作为刺激细胞，取患者外周静脉血单个核细胞(PBMC)中非贴壁细胞(淋巴细胞，T)，调整细胞密度为1×106/mL，以含1L-2，10％FCS的RPMI1640培养；将IL-18-DC、AFP-DC与IL-18/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中，共同孵育72h(设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照)，再次加入同剂量DC孵育72h，收获细胞分别称为IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T、IL-18-DC-T、DC-T和T。以IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T、S-DC-T、DC-T和T作为效应细胞，肝癌细胞株HepG2，SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞，以不同效靶比接种于96孔板，4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。
　　结果:westernblot及ELISA法检测结果显示目的基因均表达于转染的三组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR，表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T组均显示对HepG2高效特异的杀伤活性，显著高于IL-18-DC-T、DC-T组和单纯T组，其杀伤能力与效应细胞数量成正比；IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T刺激的T细胞组IFN-γ分泌显著高于IL-18-DC-T、DC-T组和T组；但IL-18/AFP-DC-T刺激组IFN-γ分泌高于AFP-DC-T而DC-T和T组IFN-γ分泌亦无明显区别。
　　结论:腺病毒介导AFP和IL-18基因修饰DC，能够在体外诱导特异性CTL效应，对表达AFP的肝癌细胞有明显的杀伤作用，而且对HepG2细胞杀伤率大于单独AFP基因转染DC组。

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树突状细胞瘤苗的研究进展

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第一部分人 IL-18、AFP 基因腺病毒表达载体的构建及鉴定

第二部分肝癌患者外周血 PBMC 来源的树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定

第三部分重组腺病毒介导 IL-18 和 AFP 基因修饰树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究

小结

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