调控牡丹PsMPT基因低温诱导表达的转录因子的分离

摘要

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是我国传统名贵花卉，享有“国色天香”，“花中之王”的美誉，深受人民的喜爱。春节牡丹催花是牡丹产业主要内容之一，但是由于不能把握催花的原理和本质，经常导致催花失败。理解休眠解除调控机理是完善催花技术、解决生产中存在问题的理论基础。已有研究表明，PsMPT（线粒体磷酸转移子）基因在低温解除牡丹休眠中的能量代谢中发挥了重要作用。阐明PsMPT基因在低温解除休眠中的表达调控机制，对深入理解低温解除休眠的调控机制具有重要意义。本研究选用山东菏泽牡丹基地4年生牡丹品种“鲁荷红”（Paeonia suffruticosa Andr.'Lu He Hong'）的健壮植株，根据实验室前期研究结果，从其基因组DNA中克隆了牡丹PsMPT启动子，并根据低温、脱水响应相关的顺式作用元件的位置构建启动子缺失表达载体，通过GUS染色，分析了启动子缺失结构在拟南芥中的表达特性，确定了PsMPT启动子中响应低温的关键顺式作用元件，并通过酵母单杂交技术从牡丹花芽均一化cDNA文库中筛选得到了部分转录因子，进而为阐明PsMPT基因的调控机制提供依据。 主要实验结果如下: 1.对PsMPT启动子1177个核苷酸进行生物信息学分析，发现其序列中包含1个低温响应元件LTRE(low temperature responsive element)，其核心序列为CCGAC;3个脱水响应元件MYC，其核心序列为CANNTG（N=A/T/G/C）。MYC调控CBF/DREB1在低温条件下的转录，推测该功能元件可能与低温响应有关。通过相应顺式作用元件的位置设计了6个启动子缺失结构，长度分别为285 bp，577 bp，624bp，912bp，1120 bp和937bp，并通过连入pBI121载体与GUS报告基因连接，最终获得了6个含上述片段的植物表达载体。 2.通过蘸花法转化拟南芥，将6个植物表达载体分别导入拟南芥，通过低温处理转基因拟南芥诱导PsMPT启动子缺失结构驱动的GUS基因表达，GUS染色分析启动子缺失结构的表达特性，根据结果初步推断，MYC-1和MYC-2可能为PsMPT启动子低温响应的关键元件，核心序列分别为CAATTG和CAGATG。 3.从低温处理0、7、14、21、28 d的牡丹花芽中提取RNA，SMARTTM法合成了双链cDNA，通过DSN酶进行cDNA均一化，使用Clontech公司的MatechmakerTM LibraryConstruction&Screening Kit构建牡丹花芽均一化cDNA文库。经测定，文库滴度达到1.77×106转化子/3μg载体DNA，高丰度cDNA丰度降低至原来的1.6％，cDNA完整性较高。该文库较大限度的将不同低温时段的牡丹花芽中所表达的基因囊括其中，为后续研究中转录因子的筛选等工作奠定了基础。 4.根据启动子缺失结构的表达特性分析结果，合成PsMPT启动子低温响应的关键元件的三重复片段，连入pHIS2.1载体，构建诱饵载体，并转化酵母Y187。通过酵母单杂交技术，使用诱饵菌株从cDNA文库中筛选得到了两个DNA结合蛋白。通过生物信息学分析发现，具有转录因子的典型结构:锌指结构和RING-finger结构，初步推测其作为转录因子在低温诱导PsMPT表达中起到重要作用。

目录

声明

摘要

1．前言

2．牡丹PsMPT系列缺失启动子的克隆

2．1 材料与试剂

2．1．1 植物材料

2．1．2 试剂

2．1．3 质粒及菌种

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 牡丹基因组DNA的提取

2．2．2 PsMPT启动子全长序列的生物信息学分析

2．2．3 PsMPT启动子缺失片段的扩增

2．2．4 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

2．2．5 克隆载体的构建

2．2．6 重组质粒的筛选与鉴定

2．2．7 PsMPT启动子缺失植物表达载体的构建

2．3 实验结果

2．3．1 牡丹花芽DNA质量检测

2．3．2 PsMPT启动子全长序列的生物信息学分析

2．3．3 PsMPT启动子的分段扩增

2．3．4 植物表达载体的构建

2．4 讨论

2．4．1 PsMPT基因的可能调控因素

2．4．2 MYC可能是低温响应的候选元件

3．2．2 启动子缺失表达载体转化农杆菌

3．2．3 蘸花法转化拟南芥及阳性植株的筛选

3．2．4 转基因拟南芥的GUS染色

3．3 实验结果

3．3．1 PCR鉴定农杆菌转化子

3．3．2 转基因拟南芥的筛选

3．3．3 转基因拟南芥的GUS染色

3．4 讨论

4．牡丹花芽均一化cDNA文库的构建

4．1 材料与试剂

4．1．1 植物材料

4．1．2 试剂

4．1．3 菌种及质粒

4．1．4 仪器

4．2 实验方法

4．2．1 牡丹花芽RNA的提取

4．2．2 酵母感受态细胞的制备

4．2．3 cDNA的合成

4．2．4 cDNA文库均一化

4．2．5 ds cDNA的纯化

4．2．6 ds cDNA和pGADT7-Rec转化酵母AH109

4．2．7 转化子的筛选和收集

4．3 实验结果

4．3．1 RNA的质检

4．3．2 cDNA的合成及均一化检测

4．3．3 文库库容鉴定

4．3．4 文库的PCR抽检

4．4 讨论

5．通过cDNA文库筛选转录因子

5．1 材料与试剂

5．1．1 试剂

5．1．2 菌种及质粒

5．1．3 仪器

5．2 实验方法

5．2．1 构建顺式元件-pHIS2．1诱饵载体

5．2．2 制备酵母Y187感受态细胞

5．2．3 诱饵载体转化酵母Y187感受态细胞

5．2．4 酵母单杂交筛选转录因子

5．2．5 转录因子的生物信息学分析

5．3 实验结果

5．3．1 诱饵载体的鉴定

5．3．2 转录因子的筛选

5．3．3 生物信息学分析

5．4 讨论

6．结论

参考文献

附录

致谢

作者简历