PAO途径的H2O2通过H2S参与乙烯调控气孔运动的信号转导

摘要

植物通过气孔运动与环境进行气体和水分交换，气孔运动影响着植物的生长发育，长久以来人们都十分重视研究气孔运动的调控机制。业已证明乙烯(ethylene，Eth)能够诱导气孔关闭，过氧化氢(hydrogenperoxide，H2O2)、一氧化氮(nitricoxide，NO)、Ca+、胞质碱化以及新型信号分子硫化氢(hydrogensulfide，H2S)等是气孔运动信号转导途径的重要组分。多胺代谢途径是植物体内H2O2的主要来源之一，但鲜见来自多胺氧化酶(polyamineoxidases，PAO)途径的H2O2在调控气孔运动中作用的报道，尚未知其与新型信号分子H2S在乙烯诱导气孔关闭信号转导链中的关系。 本文综合应用植物生理学、细胞生物学、生物信息学和分子生物学等现代生物学技术，证明PAO存在于拟南芥气孔保卫细胞中;来自PAO途径的H2O2位于H2S上游参与乙烯诱导气孔关闭的信号转导过程。 1.气孔保卫细胞中存在AtPAO2和AtPAO4，AtPAO2和AtPAO4在气孔保卫细胞的细胞核，细胞质和细胞壁中均有表达。 2.克隆拟南芥AtPAO2和AtPAO4并进行了生物信息学和表达特性分析。AtPAO2编码区包含1473个核苷酸，编码491个氨基酸;AtPAO4编码区包含1494个核苷酸，编码498个氨基酸。利用实时定量PCR分析了其表达特性，证明植物激素(脱落酸(abscisicacid，ABA)、水杨酸(salicylicacid，SA)、茉莉酸(jasmonicacid，JA))，逆境（干旱、渗透和盐胁迫），信号分子(NO、H2S、H2O2)和温度光照等影响气孔开闭运动的因子均可不同程度的提高AtPAO2和AtPAO4的转录水平。 3.从组织、细胞和分子水平证实PAO参与乙烯调控气孔运动的信号转导过程。PAO抑制剂明显抑制乙烯利诱导的气孔关闭;0.004％乙烯利可显著提高拟南芥叶片游离态和与细胞壁结合态PAO活性及AtPAO2和AtPAO4的表达。以拟南芥野生型、PAO合成突变体(Atpao2和Atpao4)为材料，结合获得的AtPAO2和AtPAO4的回复突变体检测乙烯利处理后H2O2含量、PAO活性和气孔开度的影响，结果表明，乙烯利能够明显增加拟南芥叶片及保卫细胞中的H2O2水平，有效提高PAO活性;但是乙烯利对Atpao2和Atpao4的气孔开度及H2O2积累没有明显的诱导作用，相对野生型，对Atpao2和Atpao4回复突变体气孔开度及H2O2水平增加并没有明显不同，说明AtPAO2和AtPAO4均参与乙烯诱导的气孔关闭过程中H2O2的产生。综合分析可以推测，AtPAO2和AtPAO4均参与了乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭，且可能存在一定程度的功能冗余。 4.清除H2O2可减弱乙烯利诱导的H2S含量的上升和L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(L-/D-cysteinedesulfhydraseactivities，L-/D-CDes)活性的增强;乙烯利亦可明显诱导H2O2合成突变体Atpao2、Atpao4、AtrbohF和AtrbohD叶片H2S的积累以及L-/D-CDes活性的增强，相对NADPH氧化酶途径的突变体AtrbohF和AtrbohD，0.004％乙烯利对PAO途径突变体Atpao2和Atpao4的诱导作用较为显著;H2S合成抑制剂对乙烯利诱导气孔保卫细胞和叶片的H2O2水平升高没有明显影响，乙烯利亦可以诱导Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞H2O2水平升高;且乙烯利可以显著提高拟南芥野生型、Atl-cdes和Atd-cdes突变体叶片PAO活性的增加。证明了来自PAO途径的H2O2通过作用于下游的H2S参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭。 综合以上实验结果，本论文丰富了拟南芥保卫细胞内信号转导途径:乙烯→→PAO→→H2O2→→L-/D-CDes→→H2S→→气孔关闭，使乙烯调控气孔运动的信号转导网络更加完善和清晰，为深入了解气孔的调控机制提供了新的实验证据。

目录

声明

摘要

1．前言

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．2 材料培养

2．3 主要仪器

2．4 主要试剂和溶液

2．5 培养基

2．6 实验方法

2．6．1 气孔开度的测定

2．6．2 气孔保卫细胞内H2O2的检测

2．6．3 拟南芥叶片H2O2含量的测定

2．6．4 拟南芥叶片PAO活性的测定

2．6．5 拟南芥叶片H2S含量的测定

2．6．6 拟南芥叶片L-／D-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定

2．6．7 拟南芥总RNA的提取

2．6．8 反转录

2．6．9 PCR扩增目的片段

2．6．10 PCR产物的回收纯化

2．6．11 构建重组质粒

2．6．12 E．coli感受态细胞的制备

2．6．13 转化重组质粒

2．6．14 重组质粒的鉴定

2．6．15 AtPAO2和AtPAO4回复突变体的获得

2．6．16 荧光实时定量PCR

2．6．17 AtPAO2-GFP和AtPAO4-GFP稳定表达载体的构建

3．结果与分析

3．1．PAO基因的克隆、表达特性和亚细胞定位

3．1．1 PAO基因的克隆

3．1．2 拟南芥AtPAO2和AtPAO4的表达特性分析

3．1．3 AtPAO2和AtPAO4的亚细胞定位

3．2 PAO参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭

3．2．1 PAO抑制剂对乙烯诱导的拟南芥气孔关闭的影响

3．2．2 乙烯利对拟南芥叶片PAO活性的影响

3．2．3 乙烯对拟南芥AtPAO2和AtPAO4回复突变体叶片H2O2含量和气孔开度的影响

3．3 H2S参与乙烯对拟南芥气孔运动的调控

3．3．1 AtL-CDes和AtD-CDes在根、茎、叶、花、果中的表达定位

3．3．2 H2S参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭

3．3．3 乙烯对拟南芥叶片H2S含量及L-／D-半胱氨酸脱巯基酶活性的影响

3．4 H2O2与H2S在乙烯诱导拟南芥气孔关闭中的相互关系

3．4．1 H2O2位于H2S上游介导乙烯诱导气孔关闭的可能性

3．4．2 H2O2位于H2S下游介导乙烯诱导气孔关闭的可能性

4．讨论

5．结论

6．展望

参考文献

附录

缩略词对照表

致谢

作者简历