NO和H2O2参与乙烯对拟南芥气孔运动的调控

摘要

气孔是高等植物与环境间进行水分和气体交换的重要器官，其开闭运动影响着植物的光合作用和蒸腾作用。研究表明乙烯（ethylene，Eth）能够与其它激素共同作用调控气孔运动，但鲜见乙烯调控气孔运动作用机制的报道。本论文以拟南芥野生型、一氧化氮(nitric oxide，NO)合成突变体、ETR1突变体以及多胺氧化酶(polyamine oxidases，PAO)突变体为材料，综合应用植物生理学、细胞生物学、生物信息学和分子生物学等现代生物学技术，结合药理学实验观测乙烯对气孔运动的影响，检测处理前后NO和过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）及其相关酶的变化、乙烯对气孔保卫细胞中多胺氧化酶基因表达的影响，以期从组织、细胞和分子水平证实ETR1、NO和H2O2参与乙烯调控气孔运动的信号转导过程。
　　 结果表明，光下乙烯利(0.0004％、0.004％、0.04％、0.4％)可诱导拟南芥叶片气孔关闭，且具有时间和剂量效应;乙烯利能够明显增加气孔保卫细胞和叶片的NO水平，提高叶片的硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)活性，且NO的含量与NR活性的变化趋势基本一致;NO清除剂及NR抑制剂可不同程度抑制乙烯利的诱导作用;乙烯利亦可明显诱导Atnoa1/rif1突变体气孔关闭及NO积累，但对nia1，nia2突变体没有明显影响，说明乙烯可以诱导拟南芥叶片气孔关闭，且来自NR途径的NO参与这一信号过程。
　　 乙烯利亦可明显增加气孔保卫细胞和叶片的H2O2水平，且H2O2的清除剂及合成酶抑制剂均能明显减弱乙烯利诱导气孔关闭的效应，由此推测H2O2亦是乙烯诱导气孔关闭的信号组分，且NADPH氧化酶及细胞壁过氧化物酶均参与乙烯引起的H2O2积累。清除H2O2可减弱乙烯利对NO含量和NR活性的诱导效应，推测，NO（主要由NR途径合成）可能位于H2O2下游参与调控乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭。
　　 植物体内H2O2的主要合成酶除NADPH氧化酶及细胞壁过氧化物酶外还有PAO，目前鲜见PAO途径产生的H2O2是否参与气孔运动的报道，因此本文探讨了PAO途径产生的H2O2在乙烯诱导气孔关闭过程中的作用。结果显示，PAO抑制剂明显抑制乙烯利诱导的气孔关闭及保卫细胞和叶片的H2O2积累，推测PAO可能参与乙烯利诱导的H2O2快速积累;实时定量PCR结果表明，乙烯利可以提高多胺氧化酶基因AtPAO2和AtPAO4的转录水平。利用转基因获得的过表达植株结合分离鉴定出的AtPAO2和AtPAO4的T-DNA插入突变体对AtPAO2和AtPAO4的作用进行了进一步研究，结果表明，乙烯利可以诱导过表达植株及T-DNA插入突变体H2O2的产生及气孔关闭，但对过表达植株的诱导作用要强，说明AtPAO2和AtPAO4均参与乙烯诱导的气孔关闭过程中H2O2的产生，且具有一定的功能冗余。
　　 为探明乙烯受体ETR1在乙烯调控的气孔运动中的作用机制，本文研究了乙烯利对拟南芥野生型及ETR1突变体气孔开度、NO和H2O2的影响。结果表明，乙烯对ETR1突变体气孔没有明显的调控作用，同时对ETR1突变体的NO和H2O2的合成亦没有明显影响，推测，乙烯受体ETR1参与乙烯诱导的气孔关闭及信号分子NO和H2O2的产生。
　　 综合以上实验结果，本论文提出在拟南芥保卫细胞内存在一条尚未报道过的信号转导途径:乙烯→ETR1→PAO→H2O2→NR→NO→气孔关闭，为阐明乙烯诱导气孔关闭过程中信号机制提供新的实验证据，对系统深入了解气孔运动调控机制具有重要价值。

目录

摘要

缩略词对照表

前言

材料与方法

1 实验材料

2 材料培养

3 主要仪器

4 主要试剂

5 常用溶液配制

6 培养基

7 实验方法

结果与分析

1 乙烯对拟南芥气孔运动的影响

2 NO参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭

2．1 NO参与乙烯调控的拟南芥气孔运动

2．2 NO清除剂和NO合成酶抑制剂对乙烯调控拟南芥气孔运动的影响

2．3 乙烯对拟南芥NO合成突变体NO含量及气孔开度的影响

3 H2O2参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭

3．1 H2O2参与乙烯调控的拟南芥气孔运动

3．2 H2O2清除剂和H2O2合成抑制剂对乙烯调控拟南芥气孔运动的影响

4 PAO参与乙烯诱导的拟南芥气孔保卫细胞H2O2合成

4．1 PAO合成抑制剂对乙烯调控的H2O2含量及气孔开度的影响

4．2 乙烯对拟南芥叶片PAO表达量的影响

4．3 乙烯对AtPAO2、AtPAO4突变体和过表达株系H2O2含量及气孔开度的影响

4．4 AtPAO2和AtPAO4的亚细胞定位分析

5 NO与H2O2在乙烯诱导拟南芥气孔关闭中的相互关系

6 乙烯受体ETR1在乙烯诱导的拟南芥气孔关闭中的作用机制

6．1 乙烯受体ETR1参与调控乙烯诱导的拟南芥气孔关闭

6．2 乙烯受体ETR1参与调控乙烯诱导的NO合成

6．3 乙烯受体ETR1参与调控乙烯诱导的H2O2合成

讨论

结论

参考文献

图版

致谢

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