顺铂诱导Hela细胞凋亡后超微弱发光与氧自由基水平的变化

摘要

宫颈癌仍是妇科中高发的恶性肿瘤，目前在临床治疗中，化疗是一个基本而重要的抗肿瘤手段。然而在化疗过程中仍会产生因化疗药物使用后出现药物不敏感或多药耐药（Multidrug resistance，MDR），造成治疗失败。近年来研究表明，大多数化疗药物都是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥其作用，可又如何评价其化疗效果，临床上至今仍缺乏客观的检测指标，而超微弱发光为解决这一问题提供了新的可能。任何有生命的物质可以辐射出一种极其微弱的光子流，这种现象称为生物的超微弱发光现象（Ultraweak Photon Emission，UPE），亦被称为生物系统超微弱光子辐射（Ultraweak Photn Emission From Bioluminescence）是普遍存在于有机体内的一种自发的化学发光现象。其发光强度非常弱，仅为10-104Photons/cm2·s，波长范围200～800nm，是生物体进行新陈代谢过程中细胞自发的辐射极其微弱的光子流，它广泛存在于动物、植物以及单细胞生物之中。大量研究表明，超微弱发光与生物体的许多重要生命过程，如氧化代谢、去毒作用、细胞分裂、光合作用和生长调节等，尤其是肿瘤的发生发展有着密切关系。不同细胞或同种细胞的不同生理与病理状态，其发光强度都存在着明显的差别，而有关化疗药物的应用对肿瘤细胞的超微弱发光的影响，目前研究甚少。
　　本实验通过使用化疗药物顺铂(cisplatin DDP)，在非毒性剂量下，来诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡后，研究其超微弱发光强度的变化以及细胞内氧自由基水平变化的特点，从而探讨肿瘤化疗与细胞超微弱发光之间的联系及指导临床实践奠定基础。
　　目的：探讨DDP作用于人宫颈癌Hela细胞发生凋亡，并比较用药前后细胞超微弱发光强度以及细胞内氧自由基水平的变化特点。
　　方法：
　　1．选择化疗药物DDP作用于Hela细胞，采用MTT法有效的选择DDP半抑制浓度IC50，来评价DDP对Hela细胞的细胞毒性；
　　2．分别用光镜、HE染色、流式细胞术、免疫组化法和电镜来观察Hela细胞凋亡前后的形态变化；
　　3．用IFFM-D型流动式化学发光仪检测Hela细胞凋亡前后，在不同条件下的超微弱发光强度的变化；
　　4．用化学比色法检测凋亡前后Hela细胞内MDA、SOD以及GSH含量的变化。
　　结果：
　　1．DDP的细胞毒性效果评定：当DDP浓度为3mg/L以下时，对Hela细胞无明显毒性作用（P<0.01），超过3mg/L以上时，其毒性呈剂量效应（P<0.01）；随着DDP剂量增加，对细胞存活产生明显影响。
　　2．DDP作用于Hela细胞凋亡前后的形态变化：
　　（1）光学显微镜观察：经3mg/LDDP分别作用12h，24h，48h，72h，96h后，对照组中Hela细胞体积较大，呈多边形，折光性好；实验组经DDP作用不同时间后逐渐出现脱壁和凋亡现象。
　　（2）扫描电镜下：Hela细胞组细胞表面有丰富的微绒毛，细胞间隙清晰可见，线粒体嵴完整；实验组细胞出现，凋亡细胞表面微绒毛消失，细胞之间出现间隔，细胞膜较多的球状突起。透射电镜下：Hela细胞核大而形状不规则，胞浆内含有丰富的游离核糖体、粗面内质网和线粒体，实验组凋亡和变性死亡的细胞增多，可见大小不等的凋亡细胞和凋亡小体及细胞肿胀、溶解坏死。
　　（3）流式细胞仪：经DDP作用后Hela的G2期细胞显著增多，而S期细胞明显减少（P<0.01）；且细胞凋亡率随DDP作用时间的不同明显增高，分别在24h，48h，72h为(11.4±5.8,21.8±7.9,32.5±11.6)％，（P<0.05）；
　　（4）免疫组化结果显示：对照组Hela细胞膜上p27表达为阴性，实验组Hela细胞膜上p27为阳性，且高表达约为80％；
　　3．Hela细胞经3mg/LDDP作用后，在不同条件下细胞超微弱发光强度随之增强，但明显低于对照组（P<0.01）；
　　4．经DDP作用后Hela细胞内SOD的活性显著降低（P<0.05），MDA的含量则有所升高（P<0.01），GSH的含量也明显降低（P<0.05）；
　　结论：
　　1．DDP能有效抑制Hela细胞的生长。本实验示DDP的非毒性剂量为3mg/L；
　　2．DDP作用后的Hela细胞超微弱发光强度值显著降低。其原因可能与细胞增殖速度减慢，使蛋白质氧化，DNA链断裂，细胞内氧化代谢减弱等因素有关；
　　3．DDP作用后的Hela细胞内氧自由基的含量升高，抗氧化剂的活性明显减低，使过多的氧自由基积聚，影响细胞的功能状态，导致细胞凋亡或死亡，可能是引起细胞超微弱发光强度降低的原因之一。

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前言

文献回顾

一、超微弱发光的发展历史、分类、原理及发展现状

二、自由基的定义、类型及它的生理和病理作用

正文

实验一 顺铂诱导 Hela 细胞凋亡后形态变化的观察

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验二 顺铂诱导 Hela 细胞后细胞周期的变化及p27 蛋白表达的影响

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验三 顺铂诱导 Hela 细胞后超微弱发光强度的变化

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验四 顺铂诱导 Hela 细胞后氧自由基水平变化的观察

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢