microRNA介导HAb18G/CD147分子转录后调控及其机制

摘要

肝癌是严重威胁人类健康和生命的常见的恶性肿瘤之一。尽管肝癌的危险因素已经得以很好的定义，但其发病原理仍不清楚。增强对癌细胞分化、进展的重要分子的认识有助于发展治疗肝癌的有效靶向治疗策略。HAb18G/CD147分子是由我室确定的新型肿瘤标志物，是CD147家族成员，属于免疫球蛋白超家族（immunoglobulinsuperfamily，IgSF）类粘附分子。在多种癌中高表达，而在正常组织不表达或极低表达。其不仅可以诱导成纤维细胞合成MMPs，降解肿瘤细胞周围基质，使肿瘤细胞易于扩散和转移，也可诱导内皮细胞中VEGF的表达，从而促进新生血管的生成。这些研究结果提示HAb18G/CD147分子在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用。然而，该分子的调控机制目前仍不十分清楚。
　　microRNA（miRNA）是一类长度为20-25nt，从发夹结构前体加工而来的具有基因调控功能的小分子非编码RNA，能与受其调控的靶mRNA的3’非编码区(3’UTR)互补结合，通过降解靶基因mRNA或抑制mRNA的翻译在真核基因表达的转录后调控过程中发挥重要作用，并广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期调控等过程。新的研究证明，miRNA与细胞的癌变及多种肿瘤的发生有着极为密切的关系，参与癌症的发生、发展、侵袭和转移。
　　本研究旨在阐明miRNA是否参与HAb18G/CD147分子的转录后调控及其机制。全文分为三个部分。
　　第一部分；参与HAb18G/CD147分子转录后调控的microRNA筛选与鉴定
　　利用miRNA芯片技术筛选人正常肝细胞系QZG和人肝癌细胞系SMMC-7721中表达差异的miRNA。研究发现：与正常肝细胞相比，miR-338-3p、miR-193a-3p及miR-146a在SMMC-7721中显著低表达。生物信息学预测提示miR-146a在HAb18G/CD147的3’UTR区存在可能的结合位点，其结合位点位于HAb18G/CD147的3’UTR区的第80～第86个碱基。Stem-loopRT-PCR及real-timePCR结果均表明miR-146a在QZG细胞中表达水平较SMMC7721中高，而且与HAb18G/CD147在表达水平上呈负相关。提示miR-146a有可能为HAb18G/CD147在转录后水平上的负调控miRNA分子。
　　第二部分：microRNA146a对HAb18G/CD147表达的影响
　　Westernblot结果表明，肝癌细胞（FHCC98、SMMC7721）中转染miR-146a可以显著抑制细胞内HAb18G/CD147的表达水平，而给正常肝细胞系QZG中转染AS-miR-146a以封闭内源性miR-146a的作用，可促进QZG细胞中HAb18G/CD147蛋白表达的相应上调，表明miR-146a与HAb18G/CD147存在负调控关系。利用半定量RT-PCR及RealtimePCR检测转染miR-146a/AS-miR-146a后，对细胞内HAb18G/CD147mRNA水平的影响，结果发现转染前后细胞内HAb18G/CD147mRNA水平并未发生明显改变。结果表明细胞内miR-146a对HAb18G/CD147蛋白表达的负调控，并不涉及HAb18G/CD147mRNA水平的改变，其机制为转录后调控。明胶酶谱法及人工重组基底膜侵袭小室实验显示，转染miR-146a下调两株HCC细胞（FHCC-98及SMMC7721细胞）中HAb18G/CD147分子的表达，可显著抑制HCC细胞与成纤维细胞的共培养体系中，MMPs的分泌及细胞的侵袭潜能（p<0.05）；而封闭人正常肝细胞系QZG中miR-146a，上调HAb18G/CD147蛋白分子的表达，进而可促进QZG细胞与成纤维细胞的共培养体系中，MMPs的分泌并显著提高细胞的侵袭能力（p<0.05）。综上所述，miR-146a通过负调控HAb18G/CD147参与了MMPs的分泌和细胞的侵袭和转移的调控。
　　第三部分：HAb18G/CD147分子3’UTR区中miR-146a作用靶点的鉴定
　　为检测miR-146a对HAb18G/CD147蛋白表达的负调控作用是否由于其靶位点位于HAb18G/CD147mRNA的3’UTR。我们构建了含野生型和突变型HAb18G/CD1473’UTR区的萤火虫荧光素酶报告基因载体，分别命名为pGL3-18Gwt和pGL3-18Gmut，分别与海肾素荧光酶素报告基因载体和miR-146a共转染到HEK-293细胞中。海肾素荧光酶素报告基因载体作为内对照。转染24小时后，分别检测各组细胞中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与转染空载体对照组相比，共转染pGL3-18Gwt和miR-146a组中萤火虫荧光素酶的活性显著下降(P=0.000)，而共转染pGL3-18Gmut和miR-146a组中萤火虫荧光素酶的活性则无明显变化。以上结果为miR-146a直接作用于HAb18G/CD147的3′UTR区提供了强有力的支持。
　　综上所述，本研究阐明了HAb18G/CD147的表达受miR-146a的转录后调控；miR-146a对HAb18G/CD147分子的转录后调控并不涉及后者mRNA水平的变化；miR-146a可通过调控HAb18G/CD147在细胞中的表达抑制肿瘤细胞MMPs的分泌和细胞的侵袭能力。提示miR-146a具有抑制肿瘤转移的治疗前景。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾：

第一部分：microRNA 的研究进展

一、miRNA 的结构和特点

二、miRNA 的生物发生

三、miRNA 的作用机制

四、miRNA 的功能及意义

五、miRNA 的研究方法

六、miRNA 与肿瘤

第二部分：HAb18G/CD147 分子研究进展

一、 新型肿瘤标志物 HAb18G/CD147 的鉴定（我室部分研究概况）

二、CD147 分子的蛋白结构特点及相互作用分子

三、CD147 分子的功能机制研究进展

第一部分：参与调控 HAb18G/CD147 分子的microRNA 筛选与鉴定

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分：microRNA146a 对 HAb18G/CD147 表达调控的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分：在 HAb18G/CD147 分子 3’UTR 区中miR-146a 作用靶点的鉴定

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢