在子宫内膜癌ECC-1中他莫西芬通过下调miR-585增强PAX2的表达

摘要

microRNA简称miRNA,是一类21-25个核苷酸的非编码调控性小RNA分子。miRNA主要是由RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)转录的,首先形成前体分子pri-miRNA。在细胞核内RNase Ⅲ Drosha将pri-miRNA切割成70个核苷酸左右能形成茎环结构的microRNA前体,称为pre-miRNA。然后由RAN-GTP依赖的核浆转运子exportin5将pre-miRNA从核内转移至胞质中。胞质中的RNase Ⅲ Dicer将茎环结构剪切成约21-25 nt的不完全配对的双链RNA(microRNA:microRNA*)。双链中成熟的microRNA很快整合入RISC形成miRISC复合体,抑制靶mRNA的翻译或者引发靶mRNA的降解。microRNA不仅可以和目标mRNA的3’末端非翻译区互补结合,也可以和编码区互补结合。lin-4是最早被发现的一个miRNA家族成员。Ambros等发现在线虫中lin-4可以和Lin-14 mRNA的3’UTR结合来调控Lin-14蛋白的表达。迄今为止,已在病毒、线虫、果蝇、小鼠和人等多种生物中发现了上万种的microRNA分子。它们参与了包括组织器官发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤发生等众多生命过程,尤其在多种肿瘤中都可以见到microRNA表达水平的改变。现有数据表明,microRNAs可以调控大约60％的哺乳动物基因,一个microRNA可以调控多个靶基因,同一基因也可以同时受多个microRNA调控。他莫西芬(tamoxifen,TAM)是一种选择性雌激素受体调节剂(Selective Estrogen Receptor Modulators,SERM)。在不同的组织可产生完全不同的作用,在乳腺组织中起雌激素拮抗剂的作用,可使高危女性患侵袭性乳腺癌的风险减小49%,而在子宫组织中则发挥着雌激素模拟作用,可增加患子宫内膜癌的风险。由于其在乳腺组织中的作用,他莫西芬被广泛用于雌激素受体阳性的乳腺癌综合治疗中、乳腺癌术后辅助治疗以及高危人群的预防。1985年Killackey等报道了在使用他莫西芬治疗的乳腺癌患者中发生子宫内膜癌,此后陆续有类似报道。临床统计数据显示,服用他莫西芬治疗乳腺癌的女性患者,其子宫内膜癌发病率比正常妇女高2～3倍,1996年WHO将他莫西芬正式列为致癌物。PAX2(Paired box gene2)是位于核内的转录因子,包括一个DNA结合配对域,一个截短的同源域,一个八肽区域和一个C末端转录激活结构域,调节参与细胞生长、增值、迁移及抗凋亡的一系列基因的表达。PAX2基因在介导雌激素和他莫西芬刺激的子宫内膜细胞的增殖和癌变过程中起着关键作用。PAX2的表达只在子宫内膜癌细胞中被雌激素和他莫西芬激活,而在正常的子宫内膜上皮细胞中则不能被雌激素和他莫西芬激活。在本实验中,我们主要研究在子宫内膜癌ECC-1细胞中他莫西芬对PAX2表达的调节机制,寻找对其有调节作用的microRNA分子。首先我们用他莫西芬刺激子宫内膜癌ECC-1细胞,无刺激剂组作为对照,可以检测到PAX2蛋白以及mRNA表达水平的升高。为了探寻microRNA在这个调节过程中的作用,我们利用Microcosm Targets预测了PAX2相关的microRNA:hsa-miR-504,hsa-miR-362-5p,hsa-miR-186,hsa-miR-135b*,hsa-miR-99a*,hsa-miR-604,hsa-miR-937,hsa-miR-671-3p,hsa-miR-886-3p,hsa-miR-181c*,hsa-miR-585。为了验证这些预测出的microRNA中哪些有可能起作用,我们用实时定量PCR检测了刺激组与对照组中这些microRNA的表达水平,结果显示他莫西芬刺激的ECC-1细胞中miR-135b*,miR-604,miR-585,miR-181c*的表达均显著下调。我们合成了这4种microRNA的mimics以及阴性对照。将这4种microRNA mimics和阴性对照分别转染ECC-1细胞,转入后继续培养48h。Western Blot结果显示转染了miR-585的ECC-1细胞中PAX2蛋白表达水平较对照组下降,而RT-PCR显示转染了miR-585的ECC-1细胞中PAX2 mRNA水平较对照组无明显差异。说明在ECC-1细胞中,他莫西芬刺激不仅使PAX2 mRNA转录增强引起蛋白表达升高,可能还通过抑制miR-585对其进行调控。这一结果为进一步阐明他莫西芬引起子宫内膜癌发病率上升的机制,进而开拓microRNA新疗法奠定了基础。但是他莫西芬作用后,miR-585表达下调的机制尚待进一步阐明。

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

第一部分 microRNA的研究进展

第二部分 他莫西芬、PAX2与子宫内膜癌

论文正文

实验材料

实验方法及结果

一、ECC-1细胞的培养以及他莫西芬刺激条件

二、他莫西芬对 PAX2蛋白表达的调节作用

三、预测 PAX2相关的microRNA

四、PAX2相关microRNA的实时定量PCR检测

五、microRNA mimics对ECC-1细胞的转染

六、转染的microRNA对 PAX2 蛋白表达的调节作用

讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢