氯通道ClC-3、ClC-4和ClC-5在成骨细胞分化中的作用

摘要

研究背景：
　　在人的一生中骨总是在不断的改建与重塑，正畸治疗正是利用骨吸收与骨改建的原理治疗错牙合畸形的一门学科，因此对于骨形成与骨改建机理的揭示对于正畸治疗理论基础研究是至关重要的。成骨细胞是参与骨形成及骨改建过程的重要细胞，成骨细胞的增殖、分化及调控是骨形成机理研究的重要内容。研究表明许多因素参与调节细胞的成骨分化，已发现有许多离子通道与细胞的成骨分化有关，如Ca2+、K+等，作为体内最主要的阴离子通道——氯通道在成骨分化中的作用还知之甚少。
　　近年来，随着对氯通道结构的深入认识，和一些与氯通道基因突变相关的人类遗传性疾病的发现与研究，氯通道在生物体内的重要作用越来越引起了人们的关注。ClC型氯通道是一大类电压门控型的氯通道，构成了一个大的基因家族。其中，ClC-3、ClC-4和ClC-5为内体系统的ClC型氯通道，由于其基因序列的高度相似性组成了ClC型氯通道家族的一个分支，主要参与神经细胞突触囊泡和细胞内体的酸化作用。近年来，研究发现内体系统的ClC型氯通道基因敲除的小鼠表现出生长阻滞及骨发育的异常，提示我们ClC-3、ClC-4和ClC-5可能与细胞的成骨分化有关。
　　研究目的：
　　本研究目的在于观察ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因在成骨细胞分化过程中的表达变化，从而进一步探求ClC-3、ClC-4和ClC-5在成骨细胞分化中的作用，并初步研究分析其作用机制。
　　研究方法：
　　体外分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞，原代培养小鼠颅顶骨来源的成骨细胞及小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1，利用RT-PCR方法检测ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因在以上三种成骨谱系细胞中的表达。利用成骨条件培养液对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导培养，用RT-PCR及real-timePCR方法检测细胞成骨诱导过程中ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的表达变化。利用脂质体转染含ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因全长的质粒，构建瞬时过表达ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的MC3T3-E1细胞体系。同样，利用脂质体转染ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的干扰siRNA，构建干扰ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因表达的MC3T3-E1细胞体系。用RT-PCR及real-timePCR方法检测两种基因表达体系中，成骨相关基因的表达变化。在基因过表达体系中，检测细胞体外矿化能力的变化，并检测细胞内细胞器的酸碱变化。用细胞免疫荧光方法，利用激光共聚焦显微镜对MC3T3-E1细胞中的氯通道及TGF-β1进行定位。分析前期研究结果，进一步对氯通道在成骨分化中的作用机制进行研究。
　　研究结果：
　　RT-PCR结果显示，在小鼠骨髓间充质干细胞、原代培养小鼠颅顶成骨细胞以及小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞中均有ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的阳性表达。在MC3T3-E1细胞成骨诱导培养中，伴随成骨相关基因ALP、BSP、OC、Runx2的表达增强，ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的表达也显著增强。在过表达ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的MC3T3-E1细胞中，成骨相关基因ALP、BSP、OC、Runx2的表达增强，细胞内内体系统的酸化作用加强，细胞体外的矿化能力明显加强。在干扰了ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因表达的MC3T3-E1细胞中，成骨相关基因ALP、BSP、OC、Runx2的表达显著降低。在细胞免疫荧光实验中发现，ClC-3氯通道定位于细胞内核周围内体和溶酶体等细胞器。ClC-3与TGF-β1的表达有共定位，且过表达ClC-3基因能明显下调TGF-β1的表达。在过表达ClC-3基因的MC3T3-E1细胞中，干扰Runx2的基因表达后，成骨相关基因ALP、BSP、OC、Runx2、Osx的表达被明显抑制。
　　结论：
　　ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道存在于小鼠骨髓间充质干细胞、原代培养小鼠颅顶成骨细胞以及小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1等成骨谱系细胞中。ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道对成骨相关基因表达有调节作用，并能增强细胞内细胞器的酸化和细胞体外矿化能力。其中，ClC-3的促成骨分化作用是通过与TGF-β1相关的Runx2途径介导的。ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因可作为参与骨形成与骨改建的新基因，有促进成骨分化的作用。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

一、 氯通道的研究进展

二、 内体系统的 ClC 氯通道的研究进展

三、 骨发育及骨改建的研究进展

四、 离子通道与骨发育及骨代谢

正文

实验一 氯通道 ClC-3、ClC-4 和 ClC-5 在骨谱细胞中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 氯通道 ClC-3、ClC-4 和 ClC-5 在诱导成骨中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 氯通道 ClC-3、ClC-4 和 ClC-5 参与MC3T3-E1 细胞分化的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 ClC-3 氯通道调节成骨分化作用机制的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢