拟南芥中LOS4基因突变影响植物耐盐性及乙烯反应的研究

摘要

高盐胁迫是影响植物生长发育的重要逆境因子。盐胁迫下植物耐盐的生理机制和分子机理阐明，对于植物对盐胁迫等逆境的适应性反应的理解及培育耐盐性作物具有重要的理论和现实意义。另外，乙烯作为气体分子激素参与植物种子萌发、果实成熟等生命活动，在植物的生长发育过程中扮演重要角色，因此阐明植物乙烯信号转导通路也具有重要的理论意义和现实意义。 拟南芥的LOS4蛋白是由AT3G53110.1基因编码DEAD-Box RNA Helicase(RNA解旋酶)，其单核苷酸隐性突变体los4-1对冷胁迫敏感。但突变体los4-1的耐盐性和其在乙烯信号转导途径中的作用未见相关报道。我们研究发现，突变体los4-1有一定的耐盐性，并且它对乙烯敏感，LOS4基因很可能在植物耐盐和乙烯信号转导调节中发挥重要作用。 主要研究结果如下: 1.突变体los4-1对盐胁迫有较强耐性。在盐处理条件下，与野生型拟南芥相比突变体los4-1有更高的萌发率，根的生长受盐胁迫抑制较小;且突变体los4-1可以在含100mM NaCl的1/2MS培养基上萌发生长，而野生型逐渐变白死亡;突变体los4-1在含NaCl的1/2MS培养基上有更高的存活率。 2.研究表明，盐胁迫情况下突变体los4-1积累更多的可溶性糖和脯氨酸，相对电导率、MDA含量却比野生型低得多，此外POD、SOD、CAT活性较野生型都有一定程度的升高，突变体los4-1的PSⅠ和PSⅡ对盐胁迫的耐性较强;而且，los4-1突变体K+/Na+和Ca2+相对含量显著高于Col-0野生型。因此，突变变los4-1对盐胁迫有较强的耐性。 3.半定量RT-PCR分析表明，基因RD17的表达量有所上调，与渗透调节物质脯氨酸合成有关的基因P5CS1在盐胁迫后始终处于高表达水平，另外液泡膜上Na+/H+反向转运蛋白基因蛋白基因AtNHX1响应提前，这说明RD17、 P5CS1、AtNHX1很可能参与突变体los4-1的耐盐调节过程，LOS4基因很可能在耐盐相关基因的表达和核质转运过程中扮演重要角色。 4.构建了35S∷ LOS4-GFP和35S∷ los4-1-GFP过表达载体，并成功转化野生型拟南芥获得了转基因植株，为进一步研究蛋白定位和基因功能奠定了基础。 5.突变体los4-1对乙烯比较敏感。研究表明光下突变体los4-1的生长也明显受到乙烯的影响，在含有不同浓度ACC的MS培养基上生长10d后，与野生型相比突变体los4-1的叶片明显变黄。此外，三重反应实验发现突变体los4-1在含0.5、5、100μM ACC的MS培养基上暗处萌发4d后的根长明显比Col-0野生型要短（其中5μM ACC下最为明显）。 6.半定量RT-PCR表明，对ACC处理后乙烯信号转导相关基因ETR1、ERS1、CTR1、EIN2、EIN3、ERFs等表达进行检测发现突变体los4-1与野生型存在明显差异，在未处理时突变体los4-1的ERS1、CTR1、EIN2、EIN3、ERFs的表达显著低于野生型，而且ACC处理后EIN2、ERS1、CTR1等基因表达量明显低于野生型。这说明LOS4基因很可能参与乙烯信号调节。

目录

声明

摘要

前言

1．植物耐盐的机制

1．1 离子的选择性积累或排出

1．2 可溶性物质的合成

1．3 根对离子的吸收和向叶片的转运

1．4 盐分下光合作用途径的改变

1．5 盐分对抗氧化酶的诱导

1．6 植物耐盐的分子机理

2．植物中DEAD-box RNA解旋酶研究进展

2．1 DEAD-box RNA解旋酶

2．2 DEAD-box RNA helicase在非生物胁迫应答过程中的作用

2．3 DEAD-box RNA helicases参与非生物胁迫应答的机制

3．拟南芥乙烯信号转导

3．1 乙烯在植物体内的信号传导

3．2 ERFs转录因子

4．研究目的与意义

第一章 拟南芥突变体los4-1的耐盐性分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 拟南芥突变体los4-1的鉴定

2．2 盐胁迫对突变体los4-1萌发率的影响

2．3 盐胁迫对突变体los4-1幼苗及根生长的影响

2．4 盐胁迫对突变体los4-1幼苗存活率的影响

2．5 盐胁迫对突变体los4-1生长的影响

2．6 盐胁迫对突变体los4-1生理生化指标的影响

2．7 突变体los4-1抗逆相关转录因子及其下游效应基因的RT-PCR检测

3．讨论

3．1 突变体los4-1耐盐的生理生化基础

3．2 突变体los4-1耐盐的分子机理

第二章 突变体los4-1乙烯相关性研究

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 ACC对突变体los4-1拟南芥生长的影响

2．2 乙烯信号转导相关基因的半定量RT-PCR检测

3．讨论

第三章 利用Gateway技术构建35S∷LOS4-GFP、35S∷los4-1-GFP表达载体

1．实验材料与试剂

1．1 实验材料

1．2 试验器材

1．3 菌株及质粒载体

1．4 试剂

1．5 实验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA质量检测

2．2 LOS4，los4-1全长CDS序列的克隆

2．3 BP反应及阳性克隆的鉴定

2．4 LR反应及阳性克隆的鉴定

2．5 pEarleyGate103转化农杆菌GV3101

2．6 LOS4-GFP和los4-1-GFP融合蛋白在洋葱表皮中的表达和定位

2．7 转基因拟南芥的筛选

3．讨论

第四章 总结

1．突变体los4-1耐盐的生理与分子机制

2．LOS4基因参与乙烯调节的机理初探

参考文献

致谢