大鼠去神经支配脾脏内淋巴细胞ERK表达变化的研究

摘要

背景：
　　神经-免疫之间相互调控关系逐渐受到人们重视，脾交感神经是脾脏自身免疫调控以及中枢神经-免疫调控的关键部分，与免疫细胞各项生理功能关系密切，通过它直接或间接调控脾脏内血流动力学改变、多种细胞因子的表达等。ERK是最早被发现的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，它是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，其家族有5个亚族，分别是ERK1-ERK5，表达十分广泛，他们传递丝裂原信号，调控多种重要的细胞生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等，甚至在行为反应和认知方面如学习、记忆等方面也起关键作用，其中以ERK1、ERK2两个亚族分布最广，功能研究也最深入。他们分别又称p44MAPK和p42MAPK，相对分子质量分别为44kD和42kD，是MAPK家族中的重要成员，并通过Ras/Raf/MEK/ERK通路其实现其功能。ERK信号级联反应能够特异地介导广泛的生物学过程，其机制主要是通过信号的反馈调控，与支架蛋白的相互作用，亚细胞定位的改变，在级联反应的每一个环节存在不同功能的多种组分，细胞内非磷酸酶抑制物和G蛋白等的调控实现的。因此，脾脏内淋巴细胞中ERK表达可以在一定程度上反映出细胞增殖、免疫应答等功能。
　　目的：
　　研究在大鼠脾脏无交感神经支配情况下，脾脏内淋巴细胞ERK表达的变化，并与正常脾脏进行比较分析，试图为脾脏神经-免疫应答调节机制提供新的研究基础。
　　方法：
　　清洁级成年雄性SD大鼠20只，随机分成实验组、对照组2组。手术切除实验组10只大鼠脾脏神经纤维，饲养1周后取出脾脏，4％多聚甲醛固定，石蜡切片行HE染色及ABC免疫组织化学染色。
　　1)首先检测PGP9.5表达情况，采用ABC免疫组织化学方法，判断实验组大鼠脾脏是否达到去神经支配要求，不计表达量，仅以有无进行判别；2)常规HE染色观察两组脾脏组织大体结构差异；3)脾脏淋巴细胞ERK表达及表达水平，同样采取ABC免疫组织化学方法检测淋巴细胞ERK表达水平，计数每5个视野下100个细胞中阳性细胞数，并采用image-proplus图像分析系统测定阳性部位的平均吸光度(meanopticaldensity,MOD)，用以代表阳性部位的蛋白表达水平。
　　结果：
　　通过切片HE染色可以看出，两组大鼠脾脏结构结构清晰，动脉周围淋巴鞘内淋巴细胞密集成团状，红髓内可见大量红细胞，在去除大鼠脾脏神经支配的实验组较对照组脾脏大体结构无明显变化。
　　两组脾脏淋巴细胞均有ERK表达，对照组正常脾脏表达ERK阳性细胞占16.2％(16.20±3.05)，主要分布于动脉周围淋巴鞘内；实验组仅占6.0％(6.0±1.63)，分布相对均匀，但仍以动脉周围淋巴鞘内居多。实验组脾脏内表达ERK明显低于对照组，差异具有显著性(P<0.01)。采用image-proplus图像处理系统分析结果看出，实验组MOD值(0.41±0.03)低于对照组(0.41±0.03)，且差异具有显著性(P<0.01)，可以看出去除神经支配后，脾脏内细胞表达ERK量低于正常脾脏，同时也说明，在脾脏在去除神经支配后，其淋巴细胞增殖活性明显降低，从而在一定程度上影响到脾脏免疫功能。
　　结论：
　　脾脏在去除交感神经支配后，脾脏内表达ERK的淋巴细胞数量明显下降，尤其是表达于胞核内比例明显降低，提示淋巴细胞增殖能力下降；正常脾脏淋巴细胞ERK表达，主要位于胞核内，说明细胞增殖活跃。并通过MOD值初步反应出无交感神经支配后淋巴细胞ERK表达量亦低于正常组。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文 献 回 顾

一、脾脏结构与生理功能

二、 脾神经与脾脏免疫功能

三、ERK 信号通路的信号转导及功能

四、意义与展望

正文

实验一 去神经支配脾脏的模型创建及筛选

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 脾脏淋巴细胞 ERK 表达情况及意义

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢