先天性静止性夜盲大鼠视杆双极细胞L-钙通道电生理特征

摘要

先天性静止性夜盲(congenital stationary night blindness，CSNB)是一类先天性、非进展性、以视网膜视杆信号系统功能障碍为主的眼科疾病，其发病机制尚不完全明确，且缺乏有效治疗手段。我们实验室发现的一种CSNB模式大鼠为编码L-钙通道的Cacna1f基因自然突变所致，主要影响视网膜视杆信号系统，电生理及行为学证明其克服了基因工程诱导模式动物与临床实际差异较大的缺陷，因此可以作为研究CSNB发病机制及视网膜信号回路之间关系的一种新模型。以往研究工作主要集中在视网膜第一级神经元水平（视杆细胞），推测其发病机制为视杆细胞突触末端膜钙通道功能障碍，后者对含递质囊泡释放产生影响，导致视觉信号传导受限而发病。该通道在视杆双极细胞（rod bipolar cells,RBCs）中也有表达，其在CSNB发病中的作用尚未见文献报道。
　　鉴于双极细胞在视觉信号转导，以及视杆与视锥回路间相互作用中起着非常重要的作用，本实验采用利用全细胞膜片钳技术对本实验室培育的CSNB大鼠RBCsL-钙通道电生理学和通道药理学特征进行观察，并探讨其与视网膜视觉信号传递障碍之间的联系。脊椎动物视网膜有非常相似的解剖结构和生理机能，不同动物的实验结果种群变异性很小，因此研究CSNB钙通道电流特征可为进一步明确这种疾病的发病机制及采取针对性的视觉干预保护措施提供依据。
　　材料与方法：
　　实验采用本实验室鉴定发现，并建立近交系的CSNB大鼠（F20/F21,4～8周龄）及正常同龄对照SD大鼠，深度麻醉后处死大鼠摘取眼球，利用手动切片机制作视网膜切片，在红外干涉显微成像系统中寻找RBCs胞体，运用全细胞膜片钳模式记录L-钙通道电流；给细胞施加阶跃刺激（从-60mV除极至0mV，时程200ms），记录程序刺激后细胞静息膜电容（restCm）的变化值（△Cm），并据此计算胞吐系数EI（Exocytotic index）；分别施加L-钙通道阻断剂nifedipine和GABA受体阻断剂PTX来观察通道的药理学特征；用应用Axon公司的pClamp8．1软件进行数据测量分析，获取RBCsL-钙通道电生理学指标。在Clampfit上选取有代表性的实验记录,导入到Origin软件进行分析和作图。
　　结果：
　　1.RBCsL-钙通道电流特征
　　给细胞施加阶跃刺激和斜坡刺激后，在SD组和CSNB组大鼠的RBCs中均可记录出内向电流，其电生理学特征符合L-钙通道电流特点：在较高除极电位激活；失活缓慢；载流离子为Ca2+:用同等浓度Mg2+代替灌流液中的Ca2+，未能记录到类似电流。
　　2.L-钙通道药理学特性
　　特异性L-钙通道阻断剂nifedipine（10μm）可以完全阻断SD组和CSNB组所记录的内向电流。结合其电生理学特征我们可以判定本实验在RBCs所记录到的内向电流为L型钙通道电流。
　　3.SD大鼠与CSNB大鼠RBCsL-钙通道电流比较
　　SD组大鼠RBCsL-钙通道于-40mV左右开放，通道电流于-20和-30mV之间达到峰值：-33.2±2.5pA（n=20）。CSNB组大鼠RBCsL-钙通道于-20mV和-30mV之间开始激活，通道电流于-15mV左右达峰，峰值为12.2±2.3pA(n=23)。
　　4.SD大鼠视网膜RBCs的负反馈电流
　　SD组较强程度除极（-20m和-30mv）时可在Ca2+电流上发现较小的外向的电流（n=11），电流大小与细胞在切片中的位置有关，位置越深外向电流越大。应用GABAA和GABAC受体阻断剂PTX（100μm）能够明显阻断这种外向电流，提示其为为RBCs的突触前GABAA和GABAC受体介导的抑制性突触后电流（inhibitorypostsynapticcurrent，IPSCS）。而在CSNB组所有记录细胞中均未发现此种外向电流。
　　5．SD大鼠与CSNB大鼠RBCs胞吐指数差异
　　给细胞施加阶跃刺激（从-60mV除极至0mV，时程200ms），记录程序刺激后restCm的变化值（△Cm）,并据此计算胞吐系数EI：SD组大鼠restCm为：4146.600±544.202fF,△Cm为29.600±7.472fF，EI：0.723±0.199；CSNB组大鼠restCm为：4356.957±549.493，△Cm为12.348±6.919，EI为0.291±0.173。SD组大鼠△Cm较CSNB组大鼠高，EI较CSNB组大鼠大，有明显差异（p<0.01）与对照组比较，CSNB大鼠的△Cm和EI明显降低（p<0.01）。
　　结论：
　　1.实验在CSNB组和SD组大鼠RBCs中所记录的电流为L-钙通电流；CSNB组大鼠RBCsL-钙通电流峰值明显小于SD组大鼠，推测CSNB大鼠电流强度降低导致胞内，尤其是突触终末的Ca2+浓度降低,难以达到触发正常速率神经递质释放所需要的浓度，因此可能会使突触终末神经递质释放发生障碍，从而影响视觉信号向下一级神经元传导。
　　2.CSNB组大鼠I-V曲线较SD组右移大约20mV，会导致通道在双极细胞暗适应生理电位范围（-70mV—-20mV）内难以除极化。
　　3.CSNB大鼠RBCs的突触前GABAA和GABAC受体介导的抑制性突触后电流（IPSCS）消失，提示其触终末神经递质释放过程发生障碍，难以触发来自AⅡACs的负反馈。这种负反馈障碍会影响rod视觉信号局部突触环路放大机制和视觉信号向神经节细胞传导的可塑性。
　　4．CSNB大鼠胞吐系数EI明显降低，说明CSNB组大鼠RBCs因为钙内流导致递质囊泡和细胞膜融合，使细胞膜表面积（胞吐系数）增加的程度明显弱于SD组大鼠。因此得到关于CSNB组RBCs触终末神经递质囊泡释放发生障碍更为直观的证据。
　　综上所述，CSNB大鼠双极细胞L-钙通道电生理特征改变会严重影响其向下级神经元释放神经递质，其可能是导致CSNB发病的机制之一。

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前言

文 献 回 顾

1. 先天性静止性夜盲

2. CSNB 动物模型

3. Cacna1f 基因及其编码蛋白

3. 4 Cav1.4 型钙通道的功能

4. 视网膜双极细胞

正文

第一部分 先天性静止性夜盲大鼠视杆双极细胞 L-钙通道电生理特征观察

1. 引言

2. 实验材料

3. 实验方法

4. 讨论

第二部分 大鼠视杆双极细胞的 L 型钙电流介导的细胞膜电容变化

1. 引言

2. 实验材料

3. 实验方法

4. 结果

5. 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢