TLR4-Myd88信号通路在异氟醚预处理诱导脑保护效应中的作用研究

摘要

脑缺血是临床上许多疾病和手术中常见的病理过程，以其高发病率、高致残率、高复发率和高死亡率而严重威胁着人们的身体健康。脑缺血再灌注损伤的发生过程中，各种信号物质、炎症因子之间的相互影响发挥着重要的作用。研究发现脑缺血过程中从损伤细胞，血管和细胞外基质中释放的一些物质可以激活TLR4受体。Toll样受体4(TLR4)作为LPS跨膜信号转导蛋白，与缺血再灌注损伤有关。LPS预处理途径首先是通过激活TLR4，经过关键转接分子Myd88，使NF-κB活化转位进核，诱发炎症级联反应。吸入麻醉药异氟醚（ISO）已在临床上广泛应用，有研究证实异氟醚可以抑制受损部位的炎症反应达到脑保护的作用，但其具体的作用机制尚未探明。新近研究发现在腹腔注射LPS诱导内毒素血症前后，ISO吸入可明显减少LPS所诱发的炎性介质的释放，改善预后。那么，ISO预处理可以抑制受损部位的炎症反应，与LPS预处理减轻的炎症反应的机制是否相同呢。本实验采用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，利用TLR4、Myd88和NF-κB探讨TLR4-Myd88信号通路在异氟醚预处理诱导脑保护机制中发挥的作用。
　　实验一不同浓度的异氟醚对大鼠局灶性脑缺血的影响
　　目的：评价异氟醚预处理诱导脑保护的剂量-效应关系。
　　方法：雄性SD大鼠40只，体重250～300g，随机分为4组：对照组：每天吸100％的氧1小时,连续5天。ISO1组、ISO2组、ISO3组：每天分别接受1小时的1％、2％、3％异氟醚预处理，连续5d，最后一次预处理后24小时制作MCAO模型，再灌注24h、48h和72h后进行神经行为学评分，72h后进行脑梗死容积测量。
　　结果：ISO2组和ISO3组在各个时间点的NDS评分明显优于对照组和ISO1(P＜0.05),ISO2组优于ISO3组(P＜0.05)，CON组与ISO1之间无统计学差别。再灌注72h后，ISO2[（26.8±4.3）％]组和ISO3[(36.5±3.7)％]组梗死容积明显低于对照组[(60.4±3.9)％]和ISO1[(50.6±5.1)％](P＜0.05),ISO2组低于ISO3组(P＜0.05)，CON组与ISO1之间脑梗死容积无显著性差异。
　　结论：异氟醚预处理能够诱导脑保护效应，且具有剂量依赖性。2％的异氟醚预处理1h/d，连续5d，能更好的保护神经细胞免受损伤。
　　实验二探讨异氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血后胶质细胞和神经元中TLR4的表达影响
　　目的：探讨异氟醚预处理对MCAO大鼠胶质细胞和神经元中TLR4表达的影响。
　　方法：雄性SD大鼠48只，体重250～300g，随机均分为3组（n=16）：Sham组仅分离血管不留置线栓；Mcao组采用线栓法制备MCAO模型，120min后再灌注；Iso组每天接受1h的2％异氟醚预处理，连续5d，最后一次预处理后24h制作MCAO模型，120min后再灌注。再灌注24h后应用免疫荧光双标法观察TLR4在胶质细胞中星形胶质细胞标记物（GFAP）、小胶质细胞标记物（OX42）以及神经元细胞标记物（Neun）的表达。
　　结果：再灌注24h后，Sham组仅有少量的TLR4免疫反应阳性细胞,Mcao组动物缺血侧半球出现大量活化的TLR4免疫反应阳性细胞。TLR4阳性细胞主要分布缺血周边区、纹状体和海马。免疫荧光双标染色显示：TLR4免疫反应阳性细胞主要是GFAP阳性的星形胶质细胞，而OX42阳性的小胶质细胞和NeuN阳性的神经元也有少数的TLR4表达。Iso组和Sham组GFAP，OX42和Neun阳性细胞数明显低于Mcao组(P＜0.05)，而Iso组与Sham组之间没有统计学意义。
　　结论：异氟醚预处理抑制TLR4的表达及胶质细胞和神经元的活化和反应性增生，TLR4在胶质细胞和神经元的表达降低可能与异氟醚预处理诱导脑保护作用有关。
　　实验三异氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注时TLR4，Myd88和NF-κB表达的影响
　　目的：评价异氟醚预处理对MCAO大鼠的TLR4，Myd88和NF-κB表达的影响
　　方法：雄性成年SD大鼠54只，体重250～300g，随机分为3组（n=18）：假手术组（Sham组）仅分离血管，不留置线栓；脑缺血再灌注组（Mcao组），采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，120min后再灌注；异氟醚预处理（Iso组）吸入2％异氟醚，1h/d，连续5d，预处理结束24h后制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。分别于再灌注24、48和72h时，采用Westernblot法测定TLR4、Myd88及NF-κB的蛋白表达水平
　　结果：Westernblot结果提示：与Sham组比较，Mcao组TLR4蛋白表达量上调，并且随着再灌注时间的延长表达增多，24h达高峰，持续到48h，72h后TLR4的蛋白表达量开始下降（P＜0.05），说明TLR4的表达是呈时间依赖性的变化。并且在Mcao组中TLR4的下游分子Myd88和NF-κB蛋白表达量增加，24h达高峰，持续到48h，72h后Myd88和NF-κB的蛋白表达量开始下降（P＜0.05），与TLR4的表达变化趋势相同。
　　结论：1.异氟醚预处理可能是通过抑制TLR4，Myd88和NF-κB蛋白表达量，减轻炎性反应，从而减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。
　　2.异氟醚预处理诱导脑保护的作用可能与TLR4-Myd88信号通路有关。

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文献回顾

1. 脑缺血再灌注损伤的机制

2．缺血耐受与吸入麻醉药预处理

3. 脑保护措施的新进展

4.TLR4-Myd88 信号转导通路

正文

实验一：不同浓度的异氟醚对大鼠局灶性脑缺血的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二：探讨异氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血后胶质细胞和神经元中TLR4 的表达影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三：异氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注时TLR4，Myd88 和NF-κB表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢