N-乙酰半胱氨酸、青藤碱在骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解中的作用

摘要

尽管人们做了大量的努力去改进支撑物的生物相容性，假体设计以及采用无菌的方法，但磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解、假体松动限制了人工关节的运用。研究显示，人工关节摩擦可产生各种磨损颗粒，如聚乙烯、骨水泥及金属颗粒，在无菌性松动中充当着重要的角色。松动假体周围组织中浸润有大量的细胞，包括吞噬细胞、异物巨细胞、成纤维细胞、破骨细胞等。颗粒被细胞吞噬后，由于细胞不能消化颗粒，在颗粒的持续刺激下，细胞分泌大量细胞因子，如IL-l、IL-6、PGE2及TNF-α等；这些细胞因子参与了骨吸收的相关生物学反应。目前认为，磨损颗粒刺激吞噬细胞等细胞释放细胞因子，活化破骨细胞前体细胞转化为破骨细胞，由破骨细胞发挥骨吸收的作用，引发假体周围骨溶解，最终导致假体发生无菌性松动。本文探讨了N-乙酰半胱氨酸和青藤碱在破骨细胞形成及破骨细胞行骨溶解过程中的作用机制，为临床预防和治疗假体松动提供理论基础。
　　第1部分：骨水泥颗粒体外诱导破骨细胞形成
　　目的：通过破骨细胞体外培养，探讨骨水泥颗粒诱导假体周围骨溶解，最终引发假体无菌性松动的机制。方法：取SD仔鼠骨髓细胞，在骨水泥颗粒的刺激下，进行体外破骨细胞培养，行TRAP染色，测定TRAP活性，观察颗粒对破骨细胞形态的影响；对骨片上形成的骨吸收陷窝行甲苯胺蓝染色观察骨水泥颗粒诱导的骨吸收作用。结果：骨水泥颗粒在体外条件下实验组TRAP染色阳性细胞数、TRAP活性及骨吸收作用均较对照组强。结论：骨水泥颗粒可诱导假体周围骨溶解，继而引发假体松动。
　　第2部分：N-乙酰半胱氨酸对骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解的影响
　　目的：探讨N-乙酰半胱氨酸对骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨吸收作用影响。方法：取SD仔鼠骨髓细胞，于5％CO2、95％空气、37℃饱和湿度条件下培养5天后，按实验要求，先与不同浓度（0，5，10，15及20mmol/L）的N-乙酰半胱氨酸培养1h，然后再给予最佳浓度（0.6mg/mL）的骨水泥颗粒刺激。48h后行TRAP染色，测定TRAP活性，ELISA法检测培养上清液IL-lβ和TNF-α含量，免疫印迹测定核因子-κB，骨磨片上骨吸收陷窝行甲苯胺蓝染色观察。结果：骨水泥颗粒能够诱导大量TRAP染色阳性的破骨细胞形成，TRAP活性升高，骨磨片上有吸收陷窝形成，IL-1β、TNF-α以及NF-κB的表达升高；N-乙酰半胱氨酸抑制了骨水泥颗粒诱导的TRAP染色阳性的破骨细胞形成及TRAP活性，呈现浓度依赖性；N-乙酰半胱氨酸也抑制了IL-lβ、TNF-α及核因子-κB的表达；N-乙酰半胱氨酸抑制了破骨细胞的骨吸收作用。结论：N-乙酰半胱氨酸可能通过抑制了IL-lβ、TNF-α及核因子-κB的表达对骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成起到明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。
　　第3部分：青藤碱对骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解的影响
　　目的：探讨青藤碱对骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解作用的影响。方法：取SD仔鼠骨髓细胞，于5％CO2、95％空气、37℃饱和湿度条件下培养5天后，按实验要求，先与不同浓度（0，0.25，0.5，0.75及1.0mmol/L）的青藤碱培养1h，然后再给予最佳浓度（0.6mg/mL）的骨水泥颗粒刺激。48h后行TRAP染色，测定TRAP活性；ELISA法检测培养上清液IL-lβ和TNF-α含量，免疫印迹测定核因子-κB，骨磨片上骨吸收陷窝行甲苯胺蓝染色观察。结果：骨水泥颗粒能够诱导大量TRAP染色阳性的破骨细胞形成，TRAP活性升高，骨磨片有吸收陷窝形成，IL-lβ、TNF-α及核因子-κB的表达升高；青藤碱抑制骨水泥颗粒诱导的TRAP染色阳性的破骨细胞形成及TRAP活性，呈现浓度依赖性；青藤碱抑制了IL-lβ、TNF-α及核因子-κB的表达；青藤碱抑制了破骨细胞的骨吸收作用。结论：青藤碱可能通过抑制IL-lβ、TNF-α及核因子-κB的表达对骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成起到明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。
　　第4部分：N-乙酰半胱氨酸和青藤碱在骨水泥颗粒诱导破骨细胞形成及骨溶解中的协同作用
　　目的：探讨N-乙酰半胱氨酸和青藤碱在骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成中的协同作用。方法：取SD仔鼠骨髓细胞，于5％CO2、95％空气、37℃饱和湿度条件下培养5天后，按实验要求，先分别与5mmol/LN-乙酰半胱氨酸，5mmol/LN-乙酰半胱氨酸+0.25mmol/L青藤碱，5mmol/LN-乙酰半胱氨酸+0.5mmol/L青藤碱，5mmol/LN-乙酰半胱氨酸+0.75mmol/L青藤碱培养1h，然后再给予最佳浓度（0.6mg/mL）的骨水泥颗粒刺激。48h后行TRAP染色，测定TRAP活性；ELISA法检测培养上清液IL-lβ和TNF-α含量，免疫印迹测定核因子-κB，骨磨片上骨吸收陷窝行甲苯胺蓝染色观察。结果：骨水泥颗粒能够诱导大量TRAP染色阳性的破骨细胞形成，TRAP活性升高，骨磨片有吸收陷窝形成，IL-lβ、TNF-α及核因子-κB的表达升高；青藤碱能抑制骨水泥颗粒诱导的TRAP染色阳性的破骨细胞形成及TRAP活性，并呈浓度依赖性；当加入5mmol/LN-乙酰半胱氨酸时抑制作用增强；青藤碱抑制了IL-lβ、TNF-α及核因子-κB的表达，当加入5mmol/LN-乙酰半胱氨酸时抑制作用增强；青藤碱抑制了破骨细胞的骨吸收作用，当加入5mmol/LN-乙酰半胱氨酸时抑制作用亦增强。结论：N-乙酰半胱氨酸和青藤碱可能通过抑制IL-lβ、TNF-α及核因子-κB的表达对骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成起到协同抑制的作用。
　　本文首先探讨了体外条件下骨水泥颗粒诱导破骨细胞形成及骨吸收的作用；其后探讨了体外条件下N-乙酰半胱氨酸和青藤碱单独以及联合作用的条件下，可以抑制骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨吸收作用；N-乙酰半胱氨酸和青藤碱可能是通过抑制IL-1β、TNF-α以及NF-κB的表达，从而达到抑制骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨吸收作用。在联合作用实验中，我发现N-乙酰半胱氨酸与青藤碱在抑制破骨细胞形成及骨吸收作用过程中具有协同作用。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

一、人工关节假体无菌性松动的发生机制

二、磨损颗粒与骨溶解

三、破骨细胞病理生理学及体外培养方法

四、信号通路与破骨细胞

五、N-乙酰半胱氨酸及青藤碱与无菌性松动

正文

实验一 骨水泥颗粒诱导体外破骨细胞形成

1 材料

2 实验方法

3 统计分析

4 结果

5 讨论

实验二 N-乙酰半胱氨酸在骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解中的作用

1 材料

2 实验方法

3 统计分析

4 结果

5 讨论

实验三 青藤碱在骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解中的作用

1 材料

2 实验方法

3 统计分析

4 结果

5 讨论

实验四 N-乙酰半胱氨酸与青藤碱在骨水泥颗粒诱导的破骨细胞形成及骨溶解中的协同作用

1 材料

2 实验方法

3 统计分析

4 结果

5 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢