大鼠耳蜗雪旺细胞体外培养、纯化及增殖的实验研究

摘要

感音神经性聋是临床工作中最常见的疾病,其发病机理和治疗方法仍在不断的探索中,目前认为主要病变部位在初级传入螺旋神经元(SGN)和耳蜗毛细胞。哺乳动物螺旋神经元和耳蜗毛细胞损伤后几乎不能再生,那么如何修复受损的SGN,如何使SGN增强在复杂的病理状态下的修复能力,如何使SGN在损伤后的特殊微环境里提高其存活率是感音神经性聋的研究方向之一。雪旺细胞是从胚胎时期周围神经系统的神经嵴前体细胞演化而来的一种胶质细胞。周围神经受损后其远端轴突和髓鞘崩解,此时雪旺细胞可以大量增殖并且吞噬远端轴突和崩解的变性坏死的碎片。雪旺细胞还可以分泌神经生长因子NGF和神经营养因子NTF,因此雪旺细胞具有可以增加神经元的存活率、促进细胞轴突生长和提高神经元再生的能力。
　　大量研究显示,移植雪旺细胞能够促进脊髓、周围神经损伤的修复并具有加快中枢神经系统脱髓鞘性疾病功能恢复的作用。然而,目前尚无关于耳蜗雪旺细胞和螺旋神经元轴突的相互作用机制的研究报道和关于耳蜗雪旺细胞与外周神经系统的其他雪旺细胞之间的相似性和差异性的报道。而弄清楚以上问题的关键在于纯化和定性耳蜗雪旺细胞。所以本研究致力于进行大鼠仔鼠耳蜗雪旺细胞的体外培养、纯化的试验,并配制一种能使耳蜗雪旺细胞快速增殖的培养液配方。
　　实验一:大鼠耳蜗雪旺细胞体外培养和纯化选用1-3d SD大鼠,无菌条件下暴露双侧听泡,在高倍镜下仔细剥离蜗壳,开放耳蜗,完整取出耳蜗组织,分离并且除去膜蜗管外侧壁的血管纹和基底膜组织,然后剪碎。用0.25％的胰蛋白酶消化,用胎牛血清中止消化,离心以后加入DMEM/F12培养液培养。3-5天后对细胞应用免疫磁珠阳性分选方法进行纯化,培养2天后进行传代接种,培养过程中对提纯后的大鼠耳蜗雪旺细胞进行形态学观察、并绘制其生长曲线,采用细胞免疫荧光染色对细胞进行S-100免疫荧光鉴定并且计算细胞纯度。结果:分离培养后所得的细胞即为雪旺细胞;利用免疫磁珠阳性分选法对培养所得的细胞进行纯化,纯化后的大鼠耳蜗雪旺细胞纯度为97％±1.2％。结论:免疫磁珠法是一种有效的分离纯化新生大鼠仔鼠耳蜗雪旺细胞的方法。所得雪旺细胞活力强、纯度高,可以用于耳蜗雪旺细胞与螺旋神经节轴突的生长和再生等相关研究。
　　实验二:耳蜗雪旺细胞增殖的试验取生长良好的第三代经免疫磁珠分离纯化的耳蜗雪旺细胞,消化后制成细胞浓度为1×104/ml的单细胞悬液,接种在96孔板上,每块6×12孔,每孔加入200μl细胞悬液,共接种10个样本。将硫酸乙酰肝素蛋白多糖HSPG和碱性成纤维细胞生长因子bFGF配置成不同浓度的的培养液。37℃,5％CO2培养,每日固定时间取一块板,连续取10天,用激发波长为490nm的酶联免疫测试仪测吸光度值,计算当天各组A值均数,以光吸收值为纵轴,时间为横轴,绘制六组耳蜗雪旺细胞的生长曲线。
　　结果:B、C、D、E、F组优于空白对照组A,有统计学意义(P0.05);B、C、D组之间无明显差别,无统计学意义;E、F组优于B、C、D组,有统计学意义;E、F组之间无明显差别,无统计学意义。这说明用含硫酸乙酰肝素蛋白多糖HSPG和碱性成纤维细胞生长因子bFGF的细胞培养液能使耳蜗雪旺细胞快速增殖,其中50ng/mlHSPG+50ng/mlbFGF生长最旺盛,A、B、C、D四组在第7天达到分裂顶峰,E、F组在第9天达到分裂顶峰。

目录

缩略语表

中文摘要

Abstract

前言

文献回顾

1. 雪旺细胞的起源和可塑性

2. 雪旺细胞的增殖机制

3. 雪旺细胞的功能

4. 与雪旺细胞相关的疾病

5. 雪旺细胞的体外分离与提纯

实验一 大鼠耳蜗雪旺细胞的体外培养和纯化

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 细胞分离纯化

1.3 细胞计数

1.4 绘制耳蜗雪旺细胞生长曲线

1.5 细胞鉴定

1.6 计算细胞纯度

2 结果

2.1 雪旺细胞的形态

2.2 耳蜗雪旺细胞免疫荧光鉴定

2.3 比色法检测耳蜗雪旺细胞增殖

3 讨论

实验二 耳蜗雪旺细胞增殖实验的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 耳蜗雪旺细胞观察

2.2 比色法检测各组不同时间的 A 值

2.3 绘制在不同培养液组耳蜗雪旺细胞的生长曲线

2.4 SPSS 分析统计结果

3 讨论

小结

参考文献

附录