HER2靶向重组蛋白候选药物e23sFv-Fdt-tBid的表达纯化工艺研究

摘要

人表皮生长因子受体2（HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2，HER2）亦称ErbB2。研究发现，HER2分子过表达于胃癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种癌组织中，并在这些肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用。目前，HER2分子已经成为肿瘤治疗领域的关键分子之一。研究人员一方面可以直接通过阻断该分子介导的HER2信号转导通路来抑制肿瘤发生发展；另一方面可以通过该分子介导相应的抗肿瘤药物进入肿瘤细胞抑制或杀伤肿瘤细胞，从而治疗HER2阳性肿瘤。
　　白喉毒素(DiphtheriaToxin，DT)是白喉杆菌所产生的外毒素，该毒素由535个氨基酸组成，包括具有核糖体依赖的酶活性的A片段和由受体结合区与转位区组成的B片段。DT的第187-196位氨基酸为转位肽（称为Fdt），可在内吞体被Furin蛋白酶酶切，并使外源蛋白转位至细胞质中发挥相应生物学功能。
　　Bid蛋白是Bcl-2家族成员，分子量大小为22kD，该蛋白定位于细胞质中，可以被caspase8和GrB等多种蛋白酶切割，形成约为15kD的截短Bid（truncatedBid，tBid）片段，tBid从细胞质转位至线粒体进而释放细胞色素c激活其它促凋亡分子，诱导细胞凋亡。
　　前期研究中，我们构建了由抗HER2分子的单链抗体e23sFv、转位肽Fdt以及促凋亡蛋白tBid构成的重组蛋白编码基因，并将该基因导入相应的原核表达载体，通过大肠杆菌表达、蛋白复性及纯化得到高纯度的具有较好生物活性的带His标签e23sFv-Fdt-tBid重组蛋白。体外细胞学实验表明该重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid可以特异性结合HER2分子并内化入HER2阳性肿瘤细胞内诱导靶细胞凋亡；动物体内抑瘤实验显示该重组蛋白具有较好的抑瘤作用，并且与化疗药物联合使用时效果更为显著。重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid对肿瘤良好的杀伤和抑制作用显示该重组蛋白有望成为新的抗肿瘤候选药物并进入临床应用。
　　然而上述研究仅限于重组抗肿瘤蛋白的实验室小量制备，并未作为候选药物进行表达纯化的工艺研究，同时，由于我们前期研究所获得的重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid均为带His标签蛋白，不符合临床药物评审相关标准。为了使该药物可以成为新的抗肿瘤候选药物并进入临床应用，我们在本研究中按照临床药物评审的要求，以无标签蛋白生产及纯化的方式进行了药用HER2阳性肿瘤靶向治疗促凋亡重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid表达及纯化工艺研究。
　　首先，我们使用原核表达系统对重组蛋白质e23sFv-Fdt-tBid进行了表达并对相关表达和纯化工艺进行了研究。我们将e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入原核表达载体PET-22b中以转化BL21（DE3）大肠杆菌，使用IPTG诱导后重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid以包涵体形式表达，但表达量较低并存在截短蛋白表达；经过表达条件及密码子优化后重组蛋白表达量得以提高，但重组蛋白质仍以包涵体形式表达并存在截短蛋白表达；通过菌种50次传代实验确定原核表达载体可以稳定遗传并且可以稳定表达重组蛋白质；通过透析复性、稀释复性及色谱复性等多种复性实验的尝试发现该重组蛋白质包涵体复性较为困难。
　　其次，我们使用毕赤酵母表达系统对重组蛋白质e23sFv-Fdt-tBid进行了表达研究。我们将e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入酵母表达载体pPICZαA中，使重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid可以与载体中的α信号肽融合并进行分泌表达。随后将重组载体电转入毕赤酵母细胞GS115和KM71H中并进行阳性克隆的筛选。SDS-PAGE与WesternBlot分析均未检测到重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid在酵母细胞中的表达。
　　最后，我们还研究了重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid在哺乳动物细胞CHO中的表达。我们将e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入pcDNA5/FRT载体，通过Flp-InTM定点整合系统使该基因整合到Flp-lnTMCHO宿主细胞基因组中的单拷贝位点上，以适当浓度的潮霉素B筛选得到定点整合重组蛋白基因的细胞克隆并使用基因组PCR和Westernblot技术检测重组蛋白的基因的整合及表达，结果表明CHO以分泌形式正确表达该重组蛋白并且不存在截短蛋白。
　　综上所述，我们进行了药用重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid的表达及纯化工艺研究，确定了较为合适的重组蛋白表达系统。该重组蛋白使用原核表达系统表达量较高并且蛋白表达稳定，但在大肠杆菌中该重组蛋白以包涵体形式表达，复性较为困难。使用毕赤酵母的α信号肽分泌表达e23sFv-Fdt-tBid，但SDS-PAGE与WesternBlot分析均未检测到重组蛋白在酵母细胞中的表达。在哺乳动物细胞CHO中，重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid以分泌表达的活性形式正确表达于细胞上清培养液中，尽管表达量较低，但是相对于其它表达系统而言，比较适合于该药用重组蛋白的生产及纯化。本研究探索了药用重组蛋白的生产及纯化相关工艺，确定了较为合适的蛋白表达系统，为重组蛋白e23sFv-Fdt-tBid的临床应用奠定基础。

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前言

文献回顾

第一部分 肿瘤抗体靶向治疗药物

1． 单克隆抗体靶向治疗药物

2． 单克隆抗体偶联靶向治疗药物

3． 小结

第二部分 HER2 靶向杀伤肿瘤研究进展

1． HER2 与肿瘤发生发展和转移的关系

2． HER2靶向治疗肿瘤研究

3． 肿瘤杀伤效应分子研究

4． 肿瘤抗体药物的内化转位研究

5． 新型 HER2 阳性肿瘤靶向免疫促凋亡重组蛋白 e23sFv-Fdt-tBid 研究

第三部分 蛋白质表达纯化研究进展

1． 蛋白质药物表达制备系统

2． 蛋白质表达优化研究

3． 包涵体蛋白质复性研究

4． 蛋白质的纯化研究

5． 小结

正文

实验一 重组蛋白 e23sFv-Fdt-tBid 在大肠杆菌系统中的表达及纯化工艺研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 重组蛋白 e23sFv-Fdt-tBid 在毕赤酵母系统中的表达研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 重组蛋白 e23sFv-Fdt-tBid 在哺乳动物细胞 CHO 中的表达研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢